冬虫夏草对慢性阻塞性肺疾病大鼠树突状细胞功能的影响*

李洪涛, 张天托△, 黄 静, 刘 慧, 川上和羲

(1中山大学附属第三医院呼吸内科， 广东 广州 510630；2日本东北大学医学部，日本 仙台 980-8575)

冬虫夏草对慢性阻塞性肺疾病大鼠树突状细胞功能的影响*

李洪涛1, 张天托1△, 黄 静1, 刘 慧1, 川上和羲2

(1中山大学附属第三医院呼吸内科， 广东 广州 510630；2日本东北大学医学部，日本 仙台 980-8575)

目的： 研究冬虫夏草对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠树突状细胞(DCs)功能的影响及其分子机制。方法将大鼠随机分为COPD模型组、冬虫夏草治疗组和正常对照组，观察各组大鼠气道病理改变，分离培养鼠DCs，ELISA法检测DCs培养上清液和DCs-T细胞共培养上清液中细胞因子含量。结果与正常对照组相比，COPD模型组和冬虫夏草治疗组的平均肺泡计数减少(Plt;0.05)，冬虫夏草治疗组高于COPD模型组，但差异无统计学意义(Pgt;0.05)。冬虫夏草治疗组DCs-T细胞共培养后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型组和正常对照组(Plt;0.05)，IL-5水平各组无显著差异(Pgt;0.05)。冬虫夏草治疗组DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型组和正常对照组(Plt;0.05)。结论冬虫夏草可促使COPD大鼠DCs产生Th1型细胞因子，机制可能与DCs产生的IL-12 p70促进T细胞产生IFN-γ有关。

肺疾病，慢性阻塞性； 冬虫夏草； 树突状细胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)本质是慢性气道非特异性炎症性疾病，吸烟是COPD发病的独立危险因素。中医认为COPD属“喘症”范畴，肺肾两虚是COPD的主要发病机制。《本草从新》中记述：“虫草性味甘平，入肺、肾二经，保肺益肾，止血化痰，已劳嗽”。 长期临床实践证实冬虫夏草(Cordycepssinensis)对缓解COPD症状，减少发作次数，改善生活质量等方面有一定作用。但冬虫夏草对COPD的作用机制尚有待阐明。新近我们研究发现冬虫夏草可通过树突状细胞(dendritic cells, DCs)调节免疫反应[1]，但冬虫夏草对COPD的免疫调节能否通过影响DCs尚不清楚。本研究采取大鼠被动吸烟的方法建立COPD模型，通过冬虫夏草喂养COPD大鼠，观察冬虫夏草对慢性阻塞性肺疾病模型DCs功能的影响，以探讨冬虫夏草防治COPD的作用机制。

材 料 和 方 法

1动物模型制作及实验分组

参照管彩虹等[2]的方法稍加修改： SD大鼠18只，体重(202±25)g，鼠龄12周，随机分组：COPD模型组、冬虫夏草治疗组、正常对照组，每组6只。(1)COPD模型组：在自制染毒箱中，每次被动吸烟10支(广东中烟工业有限责任公司羊城牌香烟，焦油量13 mg/支，烟碱量1.2 mg/支)，每天2次，每次持续30 min，共8周。(2)冬虫夏草治疗组：在COPD模型制备的基础上胃饲5 mL冬虫夏草菌粉溶液(5 g/kg)(杭州众生菌蕈生物技术有限公司)。(3)正常对照组：每天呼吸正常空气。COPD模型组和正常对照组每天胃饲5 mL的生理盐水(NS)。各组动物饲养于SPF级中山大学实验动物中心。8周末从各组中随机取1只大鼠，断颈处死取右肺中叶进行肺组织HE染色。肺组织切片在100倍光镜下观察，对每组5张切片连续计数3个视野内和十字线相交的肺泡数，除以3后得平均肺泡计数。

2试剂

鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、鼠白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)购自PeproTech；IL-2购自深圳科兴生物工程有限公司；FITC-CD83购自eBioscience；FITC标记的鼠IgG同型对照抗体购自eBioscience；DCs完全培养基包括RPMI-1640(Gibco)，10%胎牛血清(杭州四季青公司)，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 mmol/L Hepes, 1×105U/L青霉素，1×105U/L链霉素；淋巴细胞分离液购自上海生化二厂；白细胞介素-5(interleukin-5, IL-5)、干扰素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白细胞介素-12 p70 (interleukin-12 p70, IL-12 p70)的ELISA试剂盒购自深圳达科为生物科技有限公司。

3DCs的分离、培养与鉴定

(1) 细胞准备：8周末从各组中取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，抽取肝素抗凝的右心房血8～10 mL，PBS缓冲液稀释全血1倍并混匀。将混匀的全血轻轻置于淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，毛细吸管吸出中间的白膜层细胞，用RPMI-1640培养液洗涤，获得单个核细胞。(2)DCs体外诱导和培养：DCs的分离和培养参照我们前期研究[3-4]。将获得的单个核细胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液调节细胞浓度为1×109/L，加入6孔塑料培养板中(3 mL/well)，5%CO2、37 ℃培养2 h，用37 ℃预温的RPMI-1640培养液轻轻洗出非黏附细胞。然后在贴壁细胞中用RPMI-1640培养液培养，并在培养板中加入含GM-CSF 和IL-4等细胞因子，隔天半量换液，继续培养共8 d。相差倒置显微镜每天观察细胞生长及形态变化情况。调整成熟DCs浓度为2×108/L，加入Eppendorf管，每管25 μL，然后加入FITC-CD83单抗5 μL，FITC标记的鼠IgG1作为同型对照，4 ℃冰箱中避光反应30 min，预冷的PBS洗2遍，1%多聚甲醛固定后，流式细胞仪以488 nm激发光检测，至少采集10 000个细胞，以CellQuest和WinMDI软件分析，测定DCs的表型CD83。

4DCs培养上清液和DCs-T细胞共培养上清液中细胞因子含量测定

取DCs培养第8 d上清液，分别按TNF-α、IL-12 p70酶联免疫试剂盒说明书介绍的方法测定上清液中TNF-α、IL-12 p70的含量。收获各组成熟DCs和IL-2 2×105U/L培养的T淋巴细胞(采用尼龙毛柱法分离大鼠脾脏T淋巴细胞)。分别将5×105T细胞和5×104DCs加入6孔板共培养，培养72 h后收集培养上清液-70 ℃冰箱保存待测。应用抗体夹心ELISA法检测其IL-5和IFN-γ水平。取3复孔平均值。ELISA检测按操作说明书进行。

5统计学处理

结 果

1肺组织切片和平均肺泡计数

COPD模型组肺组织具有COPD病理形态学改变：支气管上皮细胞脱落，纤毛倒伏、黏连，杯状细胞增生，部分肺泡壁破坏、融合，细支气管壁及周围组织有淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞浸润。冬虫夏草治疗组上述病理改变较模型组减轻。正常对照组大鼠的肺泡结构正常，病理改变见图1。与正常对照组(62±8)相比，COPD模型组(38±16)、冬虫夏草治疗组(48±9)的平均肺泡计数减少(n=5，Plt;0.05)，冬虫夏草治疗组高于COPD模型组，但差异无统计学意义(n= 5，Pgt;0.05)。

Figure 1. Histology of lung tissues from the three groups (HE staining,×100). A:control;B:COPD;C:Cordyceps sinensis.

2各组DCs分泌细胞因子的变化

ELISA检测各组DCs培养上清液中细胞因子含量结果见表1：冬虫夏草治疗组DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型组和正常对照组，差异显著(Plt;0.05)。

3各组DCs-T细胞共培养上清液中细胞因子的变化

DCs的相差显微镜示有毛刺状突起，流式细胞仪表型检测示CD83阳性，符合我们以往研究[3-4]。各组DCs与同种自体T细胞共培养72 h，ELISA检测培养上清液中细胞因子含量见表2：冬虫夏草治疗组DCs-T细胞共培养后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型组和正常对照组，差异显著(Plt;0.05)；而IL-5水平各组无显著差异(Pgt;0.05)。

表1 各组DCs细胞上清液细胞因子变化

讨 论

鉴于吸烟是发生COPD的独立危险因素，本实验采用给大鼠反复被动吸烟的方法建立COPD模型符合人类COPD发生发展的自然过程，本实验动物模型的肺组织形态(见图1)符合慢性支气管炎阻塞性肺气肿特征，可用于COPD的实验研究。平均肺泡计数是衡量肺泡密度的标志。本研究发现，冬虫夏草治疗组平均肺泡计数虽然低于对照组，但比COPD模型组平均肺泡计数增加，说明冬虫夏草虽然不能阻止COPD的形成，但在一定程度上能有效抑制其肺泡的破坏，这对COPD的防治有积极作用。冬虫夏草属肉座菌目麦角菌科虫草属植物，为虫草菌的子座与其寄生蝙蝠蛾幼虫尸体的复合物。冬虫夏草始载于清，其具有补肺益肾、止咳化痰之效，用于久咳虚喘、劳嗽痰血等。冬虫夏草具有增强机体免疫力、抗炎、抗氧化及舒张支气管平滑肌等作用[5-6]。

表2 各组DCs-T细胞共培养后上清液细胞因子变化

冬虫夏草可通过激活巨噬细胞和DCs以调节各类免疫反应，并抑制LPS诱导的DCs激活[7-8]。Li等研究发现冬虫夏草在无炎症环境下，可促使DCs趋向于Th1型免疫反应，在炎症环境下，则由Th1型免疫反应转向为Th2型免疫反应[8]，表明冬虫夏草可通过DCs调节Th1/Th2平衡。2010年我们的一项前期研究中，通过基因敲除鼠及荧光报告分析发现冬虫夏草能激活鼠骨髓来源的DCs释放IL-12 p40、TNF-α并表达CD40而发挥免疫调节作用，从而进一步说明了冬虫夏草通过DCs调节Th1/Th2平衡的具体分子机制[1]。

然而，冬虫夏草对COPD的免疫调节能否通过影响DCs尚有待研究。本研究表明冬虫夏草治疗组DCs-T细胞共培养后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型组和正常对照组(Plt;0.05)，且冬虫夏草治疗组DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型组和正常对照组(Plt;0.05)，表明冬虫夏草可促使COPD模型DCs产生Th1型细胞因子，其机制可能与冬虫夏草干预后，COPD模型DCs产生IL-12，IL-12促使T细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ有关。而且，DCs分泌的促炎性细胞因子TNF-α也参与到免疫反应中。本研究提示冬虫夏草对COPD大鼠模型有抑制作用，与冬虫夏草促使DCs产生Th1型细胞因子，调节Th1/Th2平衡有关，从而为临床防治提供了一定的理论依据。

[1]Xiao G, Miyazato A, Abe Y, et al. Activation of myeloid dendritic cells by deoxynucleic acids fromCordycepssinensisvia a Toll-like receptor 9-dependent pathway[J]. Cell Immunol,2010,263(2):241-250.

[2]管彩虹,刘 进.冬虫夏草对慢性阻塞性肺病模型大鼠的气道炎症和肺功能的影响[J].浙江医学,2007,29(2):186-188.

[3]李洪涛,黄 瑾. 人外周血树突状细胞培养和地塞米松对其分化的影响作用[J].中国免疫学杂志,2007,23(4):360-363.

[4]李洪涛,黄 瑾,张天托. 激素预处理树突状细胞对哮喘Th2反应的影响[J].中国病理生理杂志,2009,25(10):1983-1987.

[5]Dong CH, Yao YJ.Invitroevaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia ofCordycepssinensis[J]. LWT - Food Sci Technol,2008, 41(4): 669-677.

[6]Zhou X, Luo L, Dressel W, et al. Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient ofCordycepssinensis[J]. Am J Chin Med,2008,36(5):967-980.

[7]Kuo YC, Tsai WJ, Wang JY, et al. Regulation of bronchoalveolar lavage fluids cell function by the immunomodulatory agents fromCordycepssinensis[J]. Life Sci, 2001,68(9):1067-1082.

[8]Li CY, Chiang CS, Tsai ML, et al. Two-sided effect ofCordycepssinensison dendritic cells in different physiological stages[J]. J Leukoc Biol, 2009, 85(6): 987-995.

在小鼠全身炎症反应中PGC-1α促进急性肾损伤恢复的作用

败血症相关急性肾损伤(AKI)是一种常见的疾病状态，与典型缺血性肾损伤的区别是肾小管细胞死亡的病变较轻。美国科学家最近在小鼠中的研究发现，内毒素血症能减少氧气运输到肾，但并不明显改变肾组织中的氧含量，提示肾细胞的耗氧量降低，并有肾小管线粒体肿胀和功能受损。基因表达谱显示败血症相关急性肾损伤时，与氧化磷酸化有关的基因被选择性地抑制，当肾小球功能恢复正常时这些基因可再度被激活。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)辅激活蛋白-1α(PGC-1α)是线粒体生物转化和新陈代谢的主要调节物，其活性与上述模式相符，而且受抑制程度也和AKI的程度而相对应。此外，在肿瘤坏死因子 γ(TNF-γ)的作用下，肾小管细胞下调PGC-1α的表达，降低耗氧量。然而，过量的PGC-1α与后者的作用相反。肾小球或肾小管部位特异性PGC-1α基因敲除的小鼠都能维持正常的基础肾功能，但内毒素血症能使这些小鼠的肾功能持续受损。以上结果提示，诱导PGC-1α的生成可能对恢复败血症相关急性肾损伤的肾功能有利。

J Clin Invest, 2011,121(10): 4003-4014(唐清亮)

InfluenceofCordycepssinensisoncytokineprofileofdendriticcellsinchronicobstructivepulmonaryratmodel

LI Hong-tao1, ZHANG Tian-tuo1, HUANG Jing1, LIU Hui1, KAWAKAMI Kazuyoshi2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2SchoolofMedicine,TohokuUniversity,Sendai980-8575,Japan.E-mail:zhtituli@163.com)

AIM: To investigate the effect ofCordycepssinensis(CS) on dendritic cells (DCs) in the rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).METHODSEighteen Sprague-Dawley male rats were randomly divided into 3 groups: control group, COPD group and CS group.The rats in the latter 2 groups were exposed to cigarette smoking for 8 weeks with (CS group) or without (COPD group) CS treatment. The rats in control group were maintained under normal condition. After 8 weeks,the histological changes of the right lung were observed under microscope. The DCs from the 3 groups were harvested and the supernatants of DCs were analyzed for the levels of TNF-α and IL-12 p70 by commercially available ELISA kit. The DCs were then washed and coculturedinvitrowith autologous T cells purified by a nylon cotton column. The supernatants of DCs-T coculture were collected after 72 h incubation, and analyzed for the levels of interleukin-5 (IL-5) and interferon-γ (IFN-γ) by ELISA.RESULTSAnalysis of the rat lung parenchyma revealed a significant decrease in the mean alveolar number, an indicator of alveolar density, in COPD group (38±16) and CS group (48±9) in comparison with control group (62±8). The mean alveolar number tended to be increased in CS group than that in COPD group, although this difference did not achieve statistical significance (Pgt;0.05). The concentrations of TNF-α and IL-12 p70 in the culture supernatants of DCs and IFN-γ in the supernatants of DCs-T cocluture were up-regulated in CS group as compared with those in COPD group and control group (Plt;0.05). The level of IL-5 in the DCs-T coculture supernatants of the 3 groups did not show differences with statistical significance (Pgt;0.05).CONCLUSIONThe therapeutic effects of CS on COPD rats may be related to modulation of Th1 and Th2 cell functions. This effect is probably mediated through IL-12 p70 produced by DCs and Th1 cytokine IFN-γ produced by autologous T cells.

Pulmonary disease,chronic obstructive; Cordyceps sinensis; Dendritic cells

1000-4718(2011)12-2372-04

R563.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.025

2011-07-27

2011-10-17

广东省中医药局基金资助项目(No. 2009156)；广东省医学科学基金资助项目(No. A2009194)

△通讯作者 Tel: 020-85252241; E-mail: zhtituli@163.com