低聚半乳糖含量的测定方法

徐莉，潘丽，禤开智

1(海南省出入境检验检疫局技术中心，海南 海口，570311) 2(河南工业大学 粮 油食品学院，河南 郑 州，450052)

低聚半乳糖含量的测定方法

徐莉1，潘丽2，禤开智1

1(海南省出入境检验检疫局技术中心，海南 海口，570311) 2(河南工业大学 粮 油食品学院，河南 郑 州，450052)

研 究了离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量的方法。用水、250 nmol/L NaOH溶液和1 mol/L乙酸钠溶液梯度淋洗，选用CarboPac PA10(2 mm×250 mm)色谱柱和安培检测器，测定了糖浆中各组分(乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖)的含量。3种糖在测定条件下线性相关系数为0.999 0～0.999 7，相对标准偏差为1.54% ～3.42%，样品的加标回收率为91.7% ～95.7%。

离 子色谱法，低聚半乳糖浆，半乳糖

低聚半乳糖作为一种新型功能食品添加剂，广泛应用于焙烤食品、糖果、果酱、清凉饮料、疗养食品等中。低聚半乳糖因其显著的生理功能，如对肠内的双歧杆菌和乳酸菌有增殖作用，抑制有害菌滋长，改善矿物质吸收，促进肠胃蠕动，热量低，对热和酸相对不易分解，有利于食品加工，延长商品上架期等。不仅如此，低聚半乳糖是母乳中存在的低聚糖，有人称之为母乳化的益生元。因此，低聚半乳糖渐渐地成为婴幼儿奶粉的配料之一，同时也已成为近年糖生物学的研究热点和人们关注的焦点。

由于在低聚半乳糖制品中同时含有单糖、双糖、三糖及更高的寡糖，半乳糖、葡萄糖和乳糖均为还原糖，使用化学方法直接测定很困难。本实验是在采纳AOAC2001.02［1］方法的基础上，改变阴离子交换柱和淋洗液，有效的分离葡萄糖、半乳糖和乳糖混标，并通过对酶解前后糖浆样品中半乳糖的含量变化获得糖浆中低聚半乳糖的总量，评价了方法的精密度。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

美国戴安公司ICS-3000离子色谱仪，配置四元梯度泵和电化学检测器，电子分析天平(上海分析天平仪器公司)，振荡器(常州澳华仪器有限公司)，氢氧化钠淋洗液(美国戴安公司)，醋酸钠(色谱纯，美国Sigma公司)，无水葡萄糖、半乳糖、无水乳糖标准物质(美国 Sima公司)，2.0 U/mg β-半乳糖苷酶(美国Sima公司)，低聚半乳糖浆(广东云浮新金山生物有限公司提供)，0.45 μm水系滤膜(美国millipore)，所用水均为电阻率18.3 MΩ·cm的去离子水。

1.2 色谱条件

色谱柱:分离柱 CarboPac PA10(2 mm×250 mm)，保护柱CarboPac PA10(2 mm×50 mm);流速:0.25 mL/min;柱温:30℃;进样量:25 μL;淋洗液及其梯度洗脱程序:见表1;检测器:电化学检测器脉冲安培检测。检测电位波形:0.00 s，0.10 V;0.002 s，0.10 V，开始积分;0.04 s，0.10 V，停止积分;0.41 s，－2.00 V;0.42 s，－2.00 V;0.43 s，0.60 V;0.44 s，－0.10 V;0.50 s，－0.10 V。

表1 淋洗液梯度洗脱程序

1.3 溶液的配制

混合标准溶液的配制:分别称取0.1 g(精确至0.1 m g)无水葡萄糖、无水乳糖、半乳糖于100 mL容量瓶中，用20 mg/L叠氮化钠溶液定容，配制成浓度约为1 000 μg/mL的单一标准储备液，然后根据需要加水稀释配制成不同浓度的混合标样。

叠氮化钠溶液(20 mg/L):取叠氮化钠0.02 g溶于水，定容稀释至1 000 mL。磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L):称取22.0 g KH2PO4和6.0 g K2HPO4·3H2O，加水稀释至1 000 mL，调节pH值为6.0，灭菌，冷却。酶解溶液(100 U/mL):称取适量β-半乳糖苷酶，加入磷酸缓冲溶液配制成100 U/mL酶解液。1.4 样品前处理

称取适量低聚半乳糖浆试样(约含0.1 g～0.3 g低聚半乳糖)置于50 mL聚四氟乙烯管中，加入40 mL 80℃热磷酸缓冲溶液，混匀，(80±2)℃下振荡30 min，冰浴冷却至室温后，用1 mmol/L NaOH或1 mmol/L HCl溶液调节pH值在5.7～6.3，稀释一定的倍数，为溶液A，备用。

取2个50 mL聚四氟乙烯管标号为1和2，1号管加入1 mL酶解溶液和1 mL磷酸缓冲溶液，100℃水浴加热10 min使酶钝化失活，冷却后称取20 g溶液A置于管内;2号管则直接称取20 g溶液A，加入1 mL酶解液，然后将2个乙烯管加盖旋紧摇匀，(60±2)℃下振荡器轻微振荡30 min(期间避免起泡)，冰浴冷却至室温后，1号管和2号管分别加入4 mL和5 mL 20%乙腈，称重，混匀，10 000 r/min离心10 min，过0.45 μm滤膜后测定。图1为1号管未经酶解的糖浆中葡萄糖、半乳糖和乳糖的色谱图。图2为2号管糖浆经酶解后样液的色谱图。

图1 未经酶解的糖浆色谱图

图2 糖浆经酶解后样液的色谱图

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

查阅文献发现完全参照AOAC2001.02的淋洗梯度和CarboPac PA1(2 mm ×250 mm)阴离子交换柱所得出的葡萄糖、半乳糖和乳糖混合标样分离效果欠佳，半乳糖的分离度仅为0.95;而选择相同的色谱柱，仅改变其淋洗梯度的色谱图显示半乳糖和葡萄糖并未完全分离，半乳糖的分离度也未达到 1.5［1，2］。根据PA10柱试验报告，发现对糖的分离PA10柱更优于PA1。

本实验还参考文献利用高效液相色谱示差折光检测器测定这3种糖的含量［3］，选用乙腈和水作为流动相，当体积比例为77∶23时能够得到峰型较好的谱图但葡萄糖和半乳糖的峰完全重叠(如图3所示)，尝试将流动相比例进行调节仍无法分离葡萄糖和半乳糖。因此为取得最佳的试验条件，对色谱条件进行优化，本实验选用柱容量更大的PA10离子交换色谱柱，淋洗液则选择水、250 mmol/L NaOH溶液和1mol/L乙酸钠溶液进行梯度洗脱程序。实验结果表明葡萄糖、半乳糖和乳糖能达到最佳的分离(如4所示)，完全能够满足分离度大于1.5的需要。

图3 乙腈/水(体积比77∶23)3种糖图的标准谱图

图4 三种糖的标准谱图

2.2 葡萄糖、半乳糖和乳糖的标准相关曲线和相关系数

用半乳糖、无水葡萄糖和无水乳糖混合工作标准液分别配置不同浓度制备标准工作曲线。由保留时间定性，根据混合工作标准液的浓度及各糖类组分响应峰面积，外标法定量。工作曲线线性相关系数应不小于0.999 0。3种糖的标准曲线分别为y=7.586x+1.658 0;y=9.257 5x+1.896 6;y=6.985 9x+1.629 3，相关系数为0.999 2;0.999 0;0.999 7。

2.3 低聚半乳糖浆含量的计算

由于低聚半乳糖是由一个葡萄糖分子和n个半乳糖(n=2～8)分子组成，并不能直接测定低聚半乳糖的含量。因此，只能通过酶水解使低聚半乳糖转化为半乳糖的方式来求出低聚半乳糖的含量。用高效离子色谱脉冲安培检测法测定水解后半乳糖的总量，然后减去游离的半乳糖和由无水乳糖水解产生的半乳糖，从而计算出试样中低聚半乳糖的含量。

其中游离的半乳糖可以通过标准曲线得出，无水乳糖水解产生的半乳糖由酶解前无水乳糖含量除以系数1.9计算求得，最后相减所得的半乳糖含量乘以换算系数K为糖浆中低聚半乳糖含量。本实验对低聚半乳糖浆样品作10次平行，平均值为59.3 g/100 g，RSD值为2.28%。

2.4 低聚半乳糖浆测定方法的验证

表2 无水乳糖回收率测定结果

由于无法满足直接添加低聚半乳糖进行回收试验，因此实验中采用添加无水乳糖纯品的方法来计算回收率，从而检验酶解的效率。根据低聚半乳糖浆中乳糖的含量，实验中每克低聚半乳糖浆中添加约0.2 g的乳糖进行酶解，共做10个平行实验，结果如表2所示，回收率为回收率为91.7% ～95.7%，RSD值为1.54%。

3 结束语

目前，低聚糖在我国还是一个新兴行业，能达到上千吨生产规模的只有低聚异麦芽糖和低聚果糖，低聚半乳糖还尚未形成规模。在我国生产低聚半乳糖的企业很少且缺乏相应的定量检测技术，从而也限定了低聚半乳糖在食品工业中的应用。与传统的高效液相示差法［3］、薄层色谱法［4］和液相柱前衍生化法［5］操作相对繁琐，灵敏度低相比，本研究在AOAC2001.02基础上改进的检测方法具有简便、灵敏度低和精密度高的优点，能够较好满足低聚半乳糖含量测定的需要。

［1］ Slegte J.Determination of trans-galacooligosaccharides in selected food products by ion-exchange chromatography:collaborative study［J］.J AOAC Intern ，2002 ，2(85):417－423.

［2］ 李建文，王竹，杨月欣.高效离子色谱法测定糖浆中低聚半乳糖含量［J］. 卫生研究，2006，35(5):584－586.

［3］ 甘宾宾，蒋世琼.高效液相色谱法测定乳糖酶水解产物中的糖类［J］.食品与发酵工业，2001，27(12):39－40.

［4］ 吴昊，丁鼎，杨思行.高效薄层色谱法分析低聚半乳糖及其共存物［J］.中国乳品工业，2001，29(2):25－28.

［5］ 马定远，陈君，李萍等.柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成［J］.分析化学，2002，30(6):702－705.

Study on the Determination Method of Galacto-oligosaccharide

Xu Li1，Pan Li2，Xuan Kai-zhi1
1(Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，china)2(College of Grain，Oil and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

An ion chromatography method was developed for determination of galacto-oligosaccharide in syrup.The components of syrup was eluted with water，250 mmol/L sodium hydroxide solution and 1mol/L sodium acetate solution in gradient，and using the CarboPac PA10(2 mm ×250 mm)column and amperometric detector.The method presented linear correlation coefficient between 0.999 0 and 0.999 7，relative standard deviation(RSD)1.54%and 3.42%.The recoveries of the lactose in syrup sample ranged from 91.7%to 5.7%.The method has many advantages，such as simple operation，fast determination，accurate and highly sensitive.

ion chromatography，galacto-oligosaccharide syrup，galactose

硕士研究生。

2010－03－14，改回日期:2010－11－18