细菌生物膜的防治进展

丁进亚，黄前川(综述)，曹军皓(审校)

(广州军区武汉总医院检验科，武汉430070)

生物膜是微生物细胞(如细菌、真菌、原虫)及其产生的细胞外大分子多聚物所形成的一种特殊细菌群落，具有高度的组织化。生物膜的形成是一个动态过程，包括可逆性黏附、不可逆性黏附、微菌落形成、生物膜成熟和解聚等阶段，任何一阶段的异常都将影响生物膜的形成。

1 抗菌生物材料

细菌在材料表面黏附是生物膜形成的第一步，阻止细菌在材料表面黏附将有效抑制生物膜的形成。

1.1 聚乙二醇 改变生物材料表面物理化学性质包括:使材料表面极度亲水或疏水;使材料表面带更多的负电荷;在材料表面涂附白蛋白及肝素等都能有效防止细菌在材料表面的黏附多种方式。在众多的生物材料中，聚乙二醇是目前所知的最为亲水的聚合物，具有很大的排斥体积以及很大的反渗透压，产生很强的抗细菌黏附的能力，常常被用来做表面改性剂［1，2］。经聚乙二醇涂附的生物材料，对大多数革兰阴性菌有很好的抗菌作用［3］，对金黄色葡萄球菌的黏附抑制力也可达到89%～93%［4］。

1.2 重金属或生物活性分子 银的抗菌谱非常广，利用纳米银或纳米卤化银涂附生物材料具有很好的抗感染性［5，6］。除了银可以作为抗菌剂外，其他重金属或其氧化物也可使材料产生抗菌性能，如纳米金、纳米TiO2、ZnO等［7］。另外，还可采用生物活性分子针对性地抑制某些细菌的生长，比如金黄色葡萄球菌是生物材料相关的主要致病菌之一［8］，将丝氨酸蛋白酶涂附在心血管涤纶生物材料上，可显著降低金黄色葡萄球菌的黏附因子的作用，有效地抑制生物膜的形成，其抑制作用的强度与丝氨酸蛋白酶剂量呈正相关。可见丝氨酸蛋白酶等生物活性分子在抗菌生物材料制备具有很好的前景［9］。

1.3 阳离子表面活性分子 阳离子表面活性分子季铵盐具有广谱的杀菌功能，带长链烷基的季铵盐的杀菌机制为:首先，带正电荷的N+吸附在表面带负电荷的细菌表面;然后，长链烷基刺入细菌的细胞膜，使细菌的内容物外泻而使细菌死亡。其特点是物理杀菌，所以这种杀菌性能是持久的、可恢复的。将季铵盐固定在材料表面，使材料具有杀菌功能而防止细菌生物膜的形成［10］，含有双键的季铵盐与甲基丙烯酸羟乙酯的材料共用于齿科修复，具有良好的抗菌性能，有研究［11］将含有长链烷基的季铵盐接枝在硅橡胶并进行了体外和体内动物试验，都获得了满意的抗感染效果。

2 阻止细菌间相互作用，抑制生物膜形成

细菌在生物膜过程中通过正反馈方式产生分泌一些特定的自诱导信号分子N-酰基高丝氨酸内酯调控致病基因的表达，在N-酰基高丝氨酸内酯的作用下，细胞产生大量的胞外多糖，形成微菌落，不断增厚的微菌落最终形成成熟的生物膜，这一过程称为群体感应［12，13］。可见，阻止细菌间的相互作用，将利于防止生物膜的形成。

2.1 抑制细菌的群体感应 不同的细菌存在不同的群体感应系统，如葡萄球菌有Agr(accessory gene regulator)群体感应系统、铜绿假单胞菌有lasR、rhlR和rhlL群体感应系统，N-酰基高丝氨酸内酯作为群体感应信号，除了参与生物膜的合成外，还与细菌毒性因子的产生、抗生素的合成或降解、质粒结合转移等多种生物功能相关，并可以诱导宿主细胞的凋亡［14］，是导致持续或反复感染的重要分子。Schaber等［15］报道不产生N-酰基高丝氨酸内酯信号分子的铜绿假单胞菌群体感应缺陷株，不仅毒力因子表达水平降低，而且不能在非生物表面形成生物膜。Dong等［16］用RNA干扰铜绿假单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯合成相关基因lasR、rhlR和rhlL后，显著促进成熟的生物膜解体，进一步证实了N-酰基高丝氨酸内酯在生物膜形成中的关键作用。实际上，铜绿假单胞菌本身就可以表达N-酰基高丝氨酸内酯信号分子抑制剂，该抑制剂具有很高的稳定性，耐酸碱，非常适合用于治疗与预防烧伤患者因铜绿假单胞菌引起的各种急慢性感染。如何促进细菌释放自身N-酰基高丝氨酸内酯信号分子抑制剂将是抗感染研究的方向之一。目前药物抑制N-酰基高丝氨酸内酯的研究已经取得一定的进展，实验发现氨溴索下调铜绿假单胞菌群体感应系统信号分子N-酰基高丝氨酸内酯以及N-酰基高丝氨酸内酯合成酶编码基因的表达，明显抑制野生型铜绿假单胞菌黏附及细菌生物被膜形成，并能增加抗生素对细菌生物被膜的渗透作用［17］，对成熟的细菌生物被膜结构还有破坏作用［18］。因此，抑制病原细菌的群体感应信号途径将成为控制感染和合成新型抗菌药物的重要手段。

2.2 抑制细胞外多糖的合成及功能 细胞外多糖是生物膜的结构基础和保护屏障，加强细菌对固体表面的黏附［19］，并且抑制单核巨噬细胞的吞噬作用，大多数抗生素难以透过凝胶样的胞外多糖层，临床抗感染治疗常常失败，致使感染反复发作或成为难治性慢性炎症。可见减少胞外多糖的分泌将抑制生物膜的形成，同时利于机体免疫系统对病原菌的清除。大蒜素是临床上用于抗真菌感染的常见药物，主要是通过氧化含有巯基的蛋白质使之灭活。林丽华等［20］证实，大蒜素可以干扰细菌胞外多糖的合成，高浓度大蒜素组和低浓度大蒜素组铜绿假单胞菌的黏附率明显低于生理盐水对照组;荧光显微镜定性角度也显示同样结果，随着大蒜素浓度的增加，其黏附抑制作用增强，使得生物膜的合成能力降低，说明胞外多糖影响细菌的早期黏附作用。以上结果为临床应用大蒜素治疗难治性铜绿假单胞菌生物膜感染提供了有力的实验室依据。然而，大蒜素是否通过抑制铜绿假单胞菌巯基酶而影响生物膜形成还需要进一步的探讨。细胞外多糖最重要的毒力因子是藻酸盐，在细菌的黏附和多层次生物膜结构的形成中具有关键作用。国内外均报道［21，22］，抑制藻酸盐的作用可以控制生物膜的合成，抗藻酸盐抗体中和细菌藻酸盐后可以降低其黏附性，使细菌聚集过程受阻，同时影响细菌生物被膜构建和形态，使生物被膜合成下降;与抗菌药物联合应用后，能够增强抗生素对于生物被膜的渗透性和对细菌的杀菌活性，从而对生物膜相关感染起到防治作用。

2.3 调控二价阳离子浓度 多种二价阳离子影响着生物膜的形成，观察发现低浓度铁促进鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、副球菌等多种细菌生物膜的合成，高浓度铁却抑制细菌生物膜的合成［23，24］;而钙、镁、锰、铜等阳离子对生物膜的合成作用与铁离子相反，降低游离钙的水平可使多耐药鲍曼不动杆菌在人体呼吸道上皮细胞或塑料表面的黏附及生物膜的形成能力显著降低［25］，而在富含钙离子培养基中的铜绿假单胞杆菌生物膜厚度是不含钙离子培养基的10倍［26］。目前认为，高浓度的钙离子可以稳定和促进细胞外多糖的释放，增加生物膜结构的聚集性和抑制生物膜的分解的功能［27］。因此，控制二价阳离子浓度将影响细菌生物膜的形成，乙二胺四乙酸是最常用降低游离阳离子的金属螯合剂，当细菌脂多糖中的阳离子结合乙二胺四乙酸后，不仅促进生物膜中细菌脂多糖的释放和药物的渗透性，抑制生物膜的形成，而且使成熟生物膜稳定性降低并产生产生裂解作用，乙二胺四乙酸联合庆大霉素可以完全杀灭生物膜中的细胞［28］。

2.4 环鸟苷二磷酸信号途径 环鸟苷二磷酸是原核细胞信号转导中一类新的第二信使，它的作用涉及生物膜的形成、毒力因子的表达、细胞间的通讯、激发免疫系统的应答等多个方面，是细菌生存和代谢的关键性调节因子之一。

已经证实环鸟苷二磷酸通过调控细菌运动器官鞭毛的表达和功能以及细胞外多糖的合成，影响霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、水稻白叶枯病菌等的生物膜形成。有研究对外源性环鸟苷二磷酸在生物膜形成中的作用进行了深入研究，他们用200 μmol/L的环鸟苷二磷酸与等量的生理盐水分别作用于变形链球菌在新鲜牙釉质片上形成的生物膜，在扫描电镜下观察发现:环鸟苷二磷酸处理组生物膜形成能力低于生理盐水组的50%，细菌排列无明显规律;同时检测细胞外多糖、细菌黏附和产酸能力均明显下降。研究证明，变形链球菌内部存在环鸟苷二磷酸信号通路，该通路介导变形链球菌的生物膜形成及在离体牙釉质表面的黏附;外源性环鸟苷二磷酸具有降低变形链球菌生物膜的形成，产酸、耐酸、体外黏附等特性;单独或与其他的抗龋制剂联合应用有望成为一种新型防龋方法［29］。该研究提示外源性环鸟苷二磷酸对生物膜的防治具有作用。

2.5 其他 有些特定的蛋白或多肽可直接抑制或破环生物膜的形成，如大肠埃希菌小蛋白Hha通过阻止细菌菌毛基因fimA和ihfA的转录而显著减少生物被膜的形成;抗菌肽Kappacin和生物膜退化酶则可清除成熟生物被膜内的细菌和生物被膜基质，细菌清除最高效率可以达到99%［30］。这些研究尽管还局限于体外实验，但为生物膜感染的防治提供了重要的理论依据。

3 展望

细菌生物膜是细菌生长过程中为适应生存环境而形成的一种存在形式，具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统的能力，成为临床上难治性感染的重要原因之一。其形成和发展的各个环节都可能成为治疗的靶位，目前生物膜防治的研究成果已经开始运用于临床，例如用枸橼酸钠降低游离钙、镁离子，在预防留置导管引起的生物膜感染中就有很好的临床效果［31］。今后防治生物膜感染的研究方向应该不只集中在如何阻止生物膜的形成，还应该努力研发对成熟生物膜具有分解或强穿透力的抗菌药物。

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