氯吡格雷反应性差异的分子机制研究进展

陈劲松(综述)，任艺虹(审校)

(中国人民解放军总医院心内科，北京100853)

血小板在动脉血栓形成过程中起着重要作用，抗血小板治疗已经成为动脉系统血栓性疾病防治的重要环节。然而，在近年的临床观察与研究中发现，阿司匹林与氯吡格雷均存在治疗效果的个体化差异，表现为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)，甚至表现为无反应。一般认为，氯吡格雷反应性差异发生机制大致可以归因于两方面:内因主要是遗传因素，包括药物代谢的各个环节，如吸收、转化和作用环节及环节后效应等;外因主要是环境因素，包括药物剂量、药物相互作用、合并疾病的影响，如糖尿病等。现就氯吡格雷反应性差异发生的可能分子机制的研究进展予以综述。

1 吸收环节

氯吡格雷经过小肠黏膜吸收，吸收率仅15%左右，主要与P糖蛋白有关。ABCB1基因编码的P糖蛋白是肠道黏膜上外向转运蛋白，通过将药物泵回肠道而降低其吸收，多个实验研究了ABCB1基因多态性对氯吡格雷反应性差异的影响，但研究结果缺乏一致性。Taubert等［1］在研究P糖蛋白对氯吡格雷吸收的影响时发现，含有两个ABCB1 3435T等位基因变异体可降低氯吡格雷血药浓度。其后Simon等［2］在法国急性ST段抬高心肌梗死和非ST段抬高心肌梗死注册研究中发现，ABCB1和3435T等位基因变异体与心血管不良事件的升高有关。然而，抗血小板干预的药物遗传学研究证实，ABCB1基因型与氯吡格雷对血小板聚集的影响并无显著相关性［3］。

2 转化环节

氯吡格雷是前体药物，本身没有活性，需要经过肝脏细胞色素酶P450系统代谢成为有活性药物，才能发挥抗血小板作用。已经发现参与氯吡格雷代谢的主要细胞色素酶包括:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A等，其中 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19参与氯吡格雷第一阶段转化，CYP2C9、CYP2C19、CYP2B6、CYP3A参与第二阶段转化。下面分别阐述影响氯吡格雷作用的分子机制。

2.1 CYP2C19基因多态性 目前对CYP2C19基因多态性的研究较多，CYP2C19酶蛋白在氯吡格雷的代谢活化中起重要作用，编码该酶蛋白的基因CYP2C19在人体内呈多态性表达。目前研究较多的突变体是 CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*4、CYP2C19*5，其中CYP2C19*2为最主要的突变体。

Hulot等［4］对28例健康男性研究发现，连续服用氯吡格雷 75 mg，每日 1次，7 d后 CYP2C19*1/*1个体的血小板聚集率较CYP2C19*2携带者低;Giusti等［5］研究发现，CYP2C19*2等位基因与血小板高聚集性及残留血小板反应有关，CYP2C19 681G/A多态性导致血小板对氯吡格雷的反应性降低;Trenk等［6］对797例经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)术后患者给予氯吡格雷治疗，在600 mg负荷剂量后，CYP2C19*2携带者的血小板聚集率(23.0%)较野生型患者(11.0%)高，在75 mg，每日1次维持剂量至出院前有明显差异(11.0%vs 7.0%);进一步研究发现血小板聚集率＞14%者，CYP2C19*2携带者的血小板聚集率(64.2%)较野生型患者(43.4%)高，在 75 mg，每日1次维持剂量至出院前有明显差异(41.3%vs 22.5%);出院前血小板聚集率＞14%者，随访1年后发现CYP2C19*2携带者死亡和心肌梗死的发生率较野生型高3倍。Shuldiner等［3］通过给427例健康成人连续服用氯吡格雷7 d，并进行基因多态性分析发现染色体10q24上CYP2C18-CYP2C19-CYP2C9-CYP2C8簇内13个单核苷酸多态性与氯吡格雷反应降低有关。而且，通过1年的随访观察发现，携带CYP2C19*2 突变者更容易(20.9%vs 10.0%)发生心血管缺血事件甚至死亡。Collet等［7］进行的一项多中心研究纳入259例年轻(＜45岁)心肌梗死患者，给予氯吡格雷治疗至少1个月，氯吡格雷中位治疗时间为1.07 年(0.28～3.0)，CYP2C19*2 突变不良影响持续时间从6个月直至随访结束;经多因素分析，CYP2C19*2突变是心血管事件的唯一独立预测因子;由此认为，CYP2C19*2突变是年轻心肌梗死患者服用氯吡格雷预后的一个主要的决定因子;在法国急性ST段抬高心肌梗死和非ST段抬高心肌梗死注册研究的基因学亚组分析中也发现［2］，同时含有两个无功能的CYP2C19等位基因的患者其复合终点事件(包括各种原因死亡、非致死性心肌梗死、卒中等)发生率明显增加。Sibbing等［8］在一项队列研究中也发现含有CYP2C19*2等位基因者在PCI术后30 d内发生支架血栓的风险明显增高;最近一项关于急性冠状动脉综合征患者氯吡格雷反应及支架相关事件的研究评估了CYPSC19基因型在氯吡格雷反应中的作用，结果证实携带至少一个CYP2C19*2突变体的患者更倾向于发生支架血栓，并且经多元回归模型分析后发现，CYP2C19是支架血栓风险的独立预测因子［9］。

而近来Lee等［10］对450例成功进行药物洗脱支架患者进行研究，随机分为二联抗血小板治疗组(阿司匹林+氯吡格雷)、三联抗血小板治疗组(阿司匹林+氯吡格雷+cilostazol)。通过对比研究发现，CYP2C19*3A等位基因在CR组更为多见，多元对数回归分析表明，CYP2C19*3是CR一个独立的预测因子。

因此，通过上述研究可以认为CYP2C19无功能等位基因可以显著降低氯吡格雷的代谢活性，其等位基因突变体与心血管不良事件的增加明显相关。

2.2 CYP3A4基因多态性 氯吡格雷经肝脏P450 3A4和3A5氧化后方有抗血小板活性。编码CYP3A4 的基因位于染色体7q21.3～22.1，由27 000个碱基构成，包含13个外显子和12个内含子，目前已知的CYP3A4的单核苷酸多态性位点有30多个。

Angiolillo等［11］研究了CYP3A4的4个易感位点的基因频率及基因型频率，发现其中3个单核苷酸多态性位点存在连锁不平衡现象，在所研究人群中这4个单核苷酸多态性位点组成了两种常见的单体型，其出现频率分别为58.3%和28.1%，其中携带IVS10+12A者对氯吡格雷敏感，但并未发现其余几个单核苷酸多态性位点与CR相关。Fontana等［12］对健康志愿者和PCI患者进行CYP3A4基因多态性分析，表明单一CYP3A4基因多态性可能与CR无关，但同CYP2C19联合的基因多态性可能与CR有关。韩雅玲等［13］对300例拟行冠状动脉介入患者进行分析，将其分为 CR组和非 CR组，检测患者CYP3A4基因894C＞T单核苷酸多态性的基因型和等位基因分布发现，CYP3A4 894C＞T位点在本组患者中存在多态性，分别为TT、CT和CC型，其基因型频率在 CR组和非 CR组分别为45.7%、50.0%、4.3%和 63.5%、31.7%、4.8%。结果表明，CYP3A4基因894C＞T位点的多态性可能与CR的发生有相关性。

2.3 CYP3A5基因多态性 当CYP3A5基因表达时，其CYP3A5酶蛋白量占肝脏CYP3A酶蛋白总量的50%。CYP3A5蛋白在成人体内表达呈高度多态性，有广泛的个体及种族间差异。CYP3A5基因的内含子3上6986A＞G，多态性位点与氯吡格雷的临床疗效关系密切，有AA、AG、GG 3种基因型。CYP3A5 6986A＞G位点的突变促使基因内类外显子序列(假外显子)插入成熟mRNA，并包括随后外显子的缺失和(或)其他基因内序列的插入，这些异常的剪接导致若干框内提前终止密码子的出现，变异型CYP3A5 mRNA比野生型降解更迅速、更不稳定。Busi等［14］研究发现CYP3A5*3等位基因为变异型(6986密码子显示A＞G突变)，野生型CYP3A5*1等位基因携带者的总CYP3A5 mRNA水平比CYP3A5*3纯合子显著增高。而Kim等［15］的研究发现CYP3A5*3基因型在氯吡格雷反应性差异中作用微弱。Burk等［16］报道，肝、肠活检组织中 CYP3A5*1等位基因获得的CYP3A5转录产物水平最高，且CYP3A5的诱导机制与CYP3A4相似，在诱导剂作用下可能模拟CYP3A5*1的高表达，由此认为CYP3A5的诱导对于P450在药物代谢及相互作用中的影响有重要作用。Suh等［17］进行了一项两个阶段的研究，第一阶段对两组均为16例的健康志愿者进行氯吡格雷试验，以是否携带CYP3A5*3等位基因分两组;第二阶段对348例PCI术后患者进行氯吡格雷试验。发现CYP3A4功能被抑制后，CYP3A5表达者(至少拥有1个CYP3A5*1)在服用氯吡格雷后血小板聚集率明显下降，而CYP3A5无或低表达者(CYP3A5*3/*3)，血小板聚集率无明显变化。还对PCI术后接受氯吡格雷治疗的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者进行跟踪，发现CYP3A5表达者的心血管事件的发生率明显低于 CYP3A5无表达者，由此推论CYP3A5对氯吡格雷的活性代谢起着重要作用。根据目前的研究结果，CYP3A基因型与氯吡格雷反应性的关系不如CYP2C19明显，需要更多的随机对照试验予以研究。

3 作用位点环节

二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)是引起血小板聚集最重要的物质，其作用是通过与血小板ADP受体(P2Y1和P2Y12)相结合而实现，P2Y12对血小板瀑布式活化，最终血栓形成起中心作用。氯吡格雷是选择性P2Y12受体拮抗剂，因此，P2Y12基因多态性可能影响到氯吡格雷作用效果，很多学者就此开展了深入的研究。P2Y12基因由47 000个碱基构成，含有3个外显子和2个内含子，可编码342个氨基酸，全部由外显子2编码。该基因可表达于血管平滑肌内皮细胞，成熟蛋白存在于血小板外膜并在外膜上行使生物学功能。

Fontana等［18］对98例健康志愿者进行了基因检测，发现H2单倍体携带者更易患动脉粥样硬化，对氯吡格雷反应差，提示血小板表面受体数目的增加可能是H2单倍体携带者的血小板对ADP反应增强的原因。该研究的问题在于受试对象为健康人，但有局部病理基础的血栓形成却是很复杂的过程。von Beckerath等［19］对416例行冠状动脉支架植入术的患者研究发现，携带P2Y12基因H2突变的患者和携带P2Y12基因H1的患者在ADP介导的血小板聚集方面无显著性差异。Angiolillo等［20］对119例冠状动脉支架植入术患者进行了氯吡格雷服用剂量的研究，发现带P2Y12基因多态性既不会影响氯吡格雷的起始负荷剂量和其后维持剂量，也不引起抗血小板治疗个体差异。Bura等［21］对225例18～35岁男性白人健康志愿者进行研究，发现H2单倍体既不影响氯吡格雷抗血小板作用高峰时间，也不影响氯吡格雷停药时血小板恢复时间，认为H2/H2纯合子并不是氯吡格雷用药个体差异性的唯一原因，且作用微弱。Cuisset等［22］对597例非ST段抬高的急性冠状动脉综合征患者进行研究，根据P2Y12基因型分成3组，结果显示，各基因型对氯吡格雷的反应无明显差异性。Staritz等［23］对比了43例未服氯吡格雷者与557例冠状动脉支架植入术患者的ADP介导的血小板聚集，却发现携带H2纯合子者更易发生CR。所以，关于P2Y12基因与氯吡格雷反应性的关系的研究结果存在很大的不一致性。最近两项大的队列研究法国急性ST段抬高心肌梗死和非ST段抬高心肌梗死注册研究和PAPI均未发现P2Y12基因与氯吡格雷反应性有显著相关性［2，3］。新发表的一项研究中部分患者即使调整剂量也不能提高氯吡格雷的疗效，而H2等位基因无此明显相关性［24］。

4 小结

PCI术后再狭窄是困扰医师与患者的问题，强化抗血小板治疗并不能对每一位患者都起到良好效果，日本、韩国的几项临床研究提示氯吡格雷无反应或 CR 的发生率在14%～40%［7，25，26］。目前的临床研究提示加拿大首次负荷剂量甚至给予两次负荷剂量可以提高氯吡格雷的抗血小板作用，也有研究认为合用Tirofiban可以降低选择性冠状动脉介入术后的心肌梗死发生率［27］。但氯吡格雷反应性差异的发生机制目前还不甚明了，基因多态性、药物相互作用均存在争议，研究的结果也不尽一致，甚至有研究发现前述分子机制在再发急性冠状动脉综合征患者中与对照组并无显著差异［28］。也有研究者认为导致氯吡格雷反应性差异是多个基因多态性的联合作用［29］。将来需要设计更为严格、前瞻、细分的研究方案，同时应该尽量采用血小板聚集基线水平相同的病例。

［1］Taubert D，von Beckerath N，Grimberg G，et al.Impact of P-glycoprotein on clopidogrel absorption［J］.Clin Pharmacol Ther，2006，80(5):486-501.

［2］Simon T，Verstuyft C，Mary-Krause M，et al.Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events［J］.N Engl J Med，2009，360(4):363-375.

［3］Shuldiner AR，O'Connell JR，Bliden KP，et al.Association of cytochrome P450 2C19 genotype with the antiplatelet effect and clinical efficacy of clopidogrel therapy［J］.JAMA，2009，302(8):849-857.

［4］Hulot JS，Bura A，Villard E，et al.Cytochrome P450 2C19 loss-offunction polymorphism is a major determinant of clopidogrel responsiveness in healthy subjects［J］.Blood，2006，108(7):2244-2247.

［5］Giusti B，Gori AM，Marcucci R，et al.Cytochrome P450 2C19 lossof-function ploymorphism，but not CYP3A4 IVS10+12G/A and P2Y12 T744C ploymorphisms，is associated with response variability to dual antiplatelet treatment in high-risk vascular patients［J］.Pharmacogenet Genomics，2007，17(12):1057-1064.

［6］Trenk D，Hochholzer W，Fromm MF，et al.Cytochrome P450 2C19 681G＞A ploymorphism and high on clopidogrel platelet reactivity associated with adverse 1-year clinical outcome of elective percutaneous coronary intervention with drug-eluting or bare-metal stents［J］.J Am Coll Cardiol，2008，51(20):1925-1934.

［7］Collet JP，Hulot JS，Pena A，et al.Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction:a cohort study［J］.Lancet，2009，373(9660):309-317.

［8］Sibbing D，Stegherr J，Latz W，et al.Cytochrome P450 2C19 lossof-function polymorphism and stent thrombosis following percutaneous coronary intervention［J］.Eur Heart J，2009，30(8):916-922.

［9］Giusti B，Gori AM，Marcucci R，et al.Relation of cytochrome P450 2C19 loss-of-function polymorphism to occurrence of drug-eluting coronary stent thrombosis［J］.Am J Cardiol，2009，103(6):806-811.

［10］Lee JM，Park S，Shin DJ，et al.Relation of genetic polymorphisms in the cytochrome P450 gene with clopidogrel resistance after drugeluting stent implantation in Koreans［J］.Am J Cardiol，2009，104(1):46-51.

［11］Angiolillo DJ，Fernandez-Ortiz A，Bernardo E，et al.Contribution of gene sequence variations of the hepatic cyto-chrome P450 3A4 enzyme to variability in individual responsiveness to clopidogrel［J］.Arterioscler Thromb Vasc Bio，2006，26(8):1895-1900.

［12］Fontana P，Hulot JS，Moerloose P，et al.Influence of CYP2C19 and CYP3A4 gene polymorphism on clopidogrelresponsiveness in healthy subjects［J］.J Thromb Haemost，2007，5(10):2153-2155.

［13］韩雅玲，麦晓燕，李毅，等.细胞色素P450 3A4 894C＞T位点基因多态性与氯吡格雷抵抗的关系［J］.解放军医学杂志，2008，33(8):939-942.

［14］Busi F，Cresteil T.CYP3A5 mRNA degradation by nonsense-mediated mRNA decay［J］.Mol Pharmacol，2005，68(3):808-815.

［15］Kim KA，Park PW，Park JY.Effect of CYP3A5*3 genotype on the pharmacokinetics and antiplatelet effect of clopidogrel in healthy subjects［J］.Eur J Clin Pharmacol，2008，64(6):589-597.

［16］Burk O，Koch I，Raucy J，et al.The induction of cytochrome P450 3A5(CYP3A5)in the human liver and intestine is mediated by the xenobiotic sensors pregnane X receptor(PXR)and constitutively activated receptor(CAR)［J］.J Biol Chem，2004，279(37):38379-38385.

［17］Suh JW，Koo BK，Zhang SY，et al.Increased risk of atherothrombotic events associated with cytochrome P450 3A5 polymorphism in patients taking clopidogrel［J］.CMAJ，2006，174(12):1715-1722.

［18］Fontana P，Dupont A，Gandrille S，et al.Adenosine diphosphate-induced platelet aggregation is associated with P2Y12 gene sequence variations in healthy subjects［J］.Circulation，2003，108(8):989-995.

［19］von Beckerath N，von Beckerath O，Koch W，et al.P2Y12 gene H2 haplotype is not associated with increased adenosine diphosphateinduced platelet aggregation after initiation of clopidogrel therapy with a high loading dose［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，2005，16(3):199-204.

［20］Angiolillo DJ，Fernandez-Ortiz A，Bernardo E，et al.Lack of association between the P2Y12 receptor gene polymorphism and platelet response to clopidogrel in patients with coronary artery disease［J］.Thromb Res，2005，116(6):491-497.

［21］Bura A，Bachelot-Loza C，Ali FD，et al.Role of the P2Y12 gene polymorphism in platelet responsiveness to clopidogrel in healthy subjects［J］.J Thromb Haemost，2006，4(9):2096-2097.

［22］Cuisset T，Frere C，Quilici J，et al.Role of the T744C polymorphism of the P2Y12 gene on platelet response to a 600mg loading dose of clopidogrel in 597 patients with non-ST-segment elevation acute coronary syndrome［J］.Thromb Res，2007，120(6):893-899.

［23］Staritz P，Kurz K，Stoll M，et al.Platelet reactivity and clopidogrel resistance are associated with the H2 haplotype of the P2Y12-ADP receptor gene［J］.Int J Cardiol，2009，133(3):341-345.

［24］Bonello L，Bonello-Palot N，Armero S，et al.Impact of P2Y12-ADP receptor polymorphism on the efficacy of clopidogrel dose-adjustment according to platelet reactivity monitoring in coronary artery disease patients［J］.Thromb Res，2010，125(4):e167-e170.

［25］Hoshino K，Horiuchi H，Tada T，et al.Clopidogrel resistance in Japanese patients scheduled for percutaneous coronary intervention［J］.Circ J，2009，73(2):336-342.

［26］Shim CY，Yoon SJ，Park S，et al.The clopidogrel resistance can be attenuated with triple antiplatelet therapy in patients undergoing drug-eluting stents implantation［J］.Int J Cardiol，2009，134(3):351-355.

［27］Valgimigli M，Campo G，de Cesare N，et al.Intensifying platelet inhibition with tirofiban in poor responders to aspirin，clopidogrel，or both agents undergoing elective coronary intervention:results from the double-blind，prospective，randomized Tailoring Treatment with Tirofiban in Patients Showing Resistance to Aspirin and/or Resistance to Clopidogrel study［J］.Circulation，2009，119(25):3215-3222.

［28］Brackbill ML，Kidd RS，Abdoo AD，et al.Frequency of CYP3A4，CYP3A5，CYP2C9，and CYP2C19 variant alleles in patients receiving clopidogrel that experience repeat acute coronary syndrome［J］.Heart Vessels，2009，24(2):73-78.

［29］Malek LA，Kisiel B，Spiewak M，et al.Coexisting polymorphisms of P2Y12 and CYP2C19 genes as a risk factor for persistent platelet activation with clopidogrel［J］.Circ J，2008，72(7):1165-1169.