MicroRNA在骨代谢中的研究进展

谢福平(综述)，陈 江(审校)

(1.福建医科大学研究生院，福州350004;2.福建医科大学附属口腔医院种植科，福州350002)

骨是由骨髓基质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、细胞外基质、矿物质等构成。正常生理状态下，骨是通过以上各种细胞新陈代谢维持在一个相对动态平衡状态下，假若平衡状态被打破，随之而来的是骨病理状态，如骨质疏松、石骨症。因此，研究基础病变对于疾病的了解及治疗具有相当重要的意义。

近年来，microRNA(miRNA)逐渐被人们熟知，miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注［1］。现针对miRNA在骨代谢相关研究及其进展予以综述。

1 miRNA概述

miRNA最先由Lee等［2］发现，是一种含有茎环结构的，非蛋白编码的小RNA分子(21～23个核苷酸)，类似于小干扰RNA。miRNA基因类似于许多编码蛋白基因，通常是在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，最初产物为大的具有5'帽子结构和3'多聚腺苷酸尾的微小RNA前体(pri-miRNA)。Pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下，5'帽子结构和3'多聚腺苷酸尾被剪切，变为约70个核苷酸组成的 pre-miRNA。RAN-GTP和转运蛋白(exportin)将pre-miRNA输送到细胞质中［3］。随后，另一个核酸酶Dicer将其茎环结构剪切，产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链。Dicer将成熟的RNA双链释放后，很快被一组蛋白反应结合形成RNA-蛋白复合物，被称为miRNA诱导沉默复合物。在miRNA诱导沉默复合物中，一条成熟的单链miRNA保留在这一复合体中，它能识别位于靶mRNA上3'端非编码区的结合位点。加工成熟后miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能。

miRNA以及RNA-蛋白质复合物在动物［4］和植物［5］中广泛表达。miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，具有组织特异性和时序性，决定着组织和细胞的功能特异的调节过程中起重要作用［6］。

2 miRNA与骨形成相关细胞

干细胞是存在于生物体内具有强大的分化增殖潜能的细胞，对于机体生长发育、损伤后修复、新陈代谢等均具有重大的意义。成人的基质干细胞是一类未分化的多潜能细胞，主要位于骨髓中，能分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等等。miRNA是细胞增殖分化中的重要调节分子，与干细胞的增殖分化具有极为密切的关系，不论是在动物胚胎期骨的形成阶段，还是在骨骼生长发育期抑或是成熟期，均有着重要的影响。

2.1 miRNA与胚胎期骨的发生发育 为了解miRNA在动物胚胎发育期的作用，研究者构建了Dicer基因剔除的小鼠，因为所有miRNA的成熟需要Dicer的参与，所以所有miRNA形成缺陷，这些基因缺陷鼠出生时就有明显的生长缺陷，没有母乳喂养时即死去。其骨骼大小明显比正常鼠小，尤其是软骨的分化增殖所受影响最大，因此，miRNA在骨形成阶段以及动物的生长发育都是必不可少的［7］。如果说Dicer基因缺失使得全体miRNA功能异常，引起动物生长发育异常是毫无疑问的，那么个别miRNA功能缺失会如何呢?Watanabe等［8］剔除 Dnm3os基因(转录 miR-199a、miR-199a* 、miR-214)，观察到Dnm3os基因缺失的幼犬绝大多数死于出生后1个月内。而Dnm3os基因缺失小鼠显示出许多骨骼异常症状，包括颅颌面发育不全、脊椎发育缺陷症、骨质减少等。更为重要的是，miR-199a、miR-199a*、miR-214在胚胎期表达水平明显下调。这表明，Dnm3os基因在哺乳动物骨骼正常生长过程中具有不可或缺的地位。同时也说明miRNA与胚胎期干细胞的分化及增殖关系密切。

在动物胚胎发育完成后，miRNA在干细胞行使分化功能时，依然起着至关重要的作用。Oskowitz等［9］研究发现，miRNA调节人骨髓多潜能干细胞分化及白血病抑制因子的表达;当向成骨细胞分化时，19种miRNA表达水平上调;向脂肪细胞分化时，20种miRNA表达水平上调;hsa-mir199a和hsa-mir346抑制白血病抑制因子的分泌。Bae等［10］比较干细胞和成纤维细胞miRNA表水平的差异，发现有20多种miRNA表达水平具有明显差别。显然，miRNA介导的干细胞分化是维持细胞的更新所必需的。

人的一生中，细胞总是在不断分化、增殖、凋亡，周而复始的运作以达到维持细胞的动态平衡，骨组织当然也不能例外。近年来，由于miRNA研究的风靡，许多学者将干细胞的分化与miRNA之间的关系作为研究重点。

2.2 miRNA调节干细胞分化为成骨细胞 干细胞向成骨细胞分化通常是在runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)调节下转变为前成骨细胞，前成骨细胞又接着在RUNX2、OSX作用下分化为成骨细胞，而RUNX2又受Smad家族蛋白、DLX3/5调控［11］;同时，骨形成蛋白也能影响Smad家族蛋白表达而影响干细胞的分化。骨形成蛋白与受体结合，激活Smad家族蛋白，Wnt激活。活化的Wnt依次激活卷曲蛋白、脂蛋白受体相关蛋白、DSH、轴素，形成复合物。该复合物使Axin-glycogen synthase-3β-APC复合物不稳定，从而抑制β连环蛋白水解，β连环蛋白浓度升高，移入细胞核与T细胞因子/淋巴细胞因子增强因子结合，从而促进特定基因表达，干细胞、前成骨细胞增殖，最终导致成骨细胞生成增多，并抵抗成骨细胞的凋亡［12］。

有研究［13］发现miR-29b能直接下调组蛋白脱乙酰化酶、转化生长因子β3、ⅡA型活化素A受体等蛋白生成量，这些蛋白作为成骨细胞分化抑制物，表达水平降低有利于促进成骨细胞分化。同时，miR-29b减少 COL1A1、COL5A3、COL4A2 3'端非编码区序列活性，从而减少或抑制胶原的合成。当胶原蛋白分泌达到一个稳定期时，miR-29b浓度升高，抑制胶原蛋白的合成，促进骨质矿化，利于骨质生成。

miR-206在骨形成蛋白2干预成纤维细胞系(C2C12)细胞后，表达水平下降。同样，在C2C12细胞中激活Smad1/4后亦表现为miR-206表达减少，而Pri-miR-206表达水平升高，这表明骨形成蛋白2是通过抑制Pri-miR-206转变为成熟miR-206这一环节而实现干细胞分化调节功能［14］。

在细胞和动物实验中，发现在骨形成蛋白2诱导的骨形成过程中，miR-2861［15］过表达增强骨形成蛋白2诱导的骨形成作用，反之，减少miR-2861的表达，骨形成蛋白2诱导骨形成作用被减弱。在小鼠体内沉默 miR-2861编码基因，可以观察到减少RUNX2表达，进而抑制骨形成，减少骨量，临床实验亦观察到miR-2861缺失患者，出现原发性骨质疏松症。

Schoolmeesters等［16］在研究人干细胞向成骨细胞分化时发现，miRNA-489、miRNA-27a表达水平下调，miRNA-148b表达水平上调。其中，miRNA-489、miRNA-27a靶向大量基因编码的RNA，但是AHSG、PEX7RD为二者共同的靶点。AHSG和CHRD基因编码骨形成蛋白信号蛋白抑制物;PEX7编码过氧化物体病毒基质酶受体(骨形成过程中的关键酶)。

miR-141和miR-200a作为前成骨细胞分化相关miRNA，能明显调节骨形成蛋白2诱导的前成骨细胞的分化，这种调节机制是通过抑制DLX5转录而实现的［17］。

综上所述，凡是对干细胞分化为成骨细胞的信号通路中的信号蛋白具有调节作用的miRNA，对干细胞的分化均有调节作用。据文献报道，has-miR-135b［18］、miR-204［19］、miR-26a［20］等许多 miRNA 都是通过信号通路中的信号蛋白调节，达到对干细胞分化为成骨细胞调节作用，因此在此不做赘述。

2.3 miRNA 调节软骨细胞代谢 miR-199a*［21］明显抑制早期软骨形成，减少早期标志基因如软骨寡聚基质蛋白、Ⅱ型胶原等表达，同时，miR-199 a*又能抑制Smad1/4介导的靶基因反式激活作用，这两种抑制作用都同时指向软骨生成被抑制。尽管如此，在试验中又观察到，miR-199a*随着骨形成蛋白2诱导软骨形成的过程，其表达水平逐渐上升，推测miR-199a*可能是软骨形成和成熟阶段所必需的调节器。

骨关节炎是一类严重关节性疾病，miRNA-140与骨关节炎有密切关系。Miyaki等［22］通过细胞实验发现，骨关节炎患者的软骨细胞miRNA-140表达水平明显低于正常人软骨细胞miRNA-140表达水平，并且白细胞介素1β能抑制miRNA-140的表达。这都说明在炎症状态下，miRNA-140表达水平受到影响，从而引发骨关节病。值得一提的是，Jones等［23］研究发现骨关节炎患者与正常人软骨细胞中多种miRNA表达水平具有明显差异。比较突出的是miR-9、miR-98、miR146。miR-9 和 miR-98 过表达或者miR-146表达减少，减少了白细胞介素1β诱导的肿瘤坏死因子α产出量。上述研究结果有所不同，但是它们共同表明miRNA的变化导致了骨关节炎的发生。因此，miRNA与骨关节炎的关系密切。

2.4 miRNA与破骨细胞 破骨细胞前体分化过程中，DGCR8、Dicer1、Ago2基因在miRNA生物合成起重要作用，沉默 DGCR8、Dicer、Ago2基因后，全面抑制破骨细胞转录因子表达，减少破骨细胞形成，减少骨吸收。miR-223、NFI-A、巨噬细胞集落刺激因子受体与破骨细胞形成和分化有关，其中，巨噬细胞集落刺激因子受体是破骨细胞分化功能中的重要因子。因此，miR-223通过调节NFI-A和巨噬细胞集落刺激因子受体水平，而达到对破骨细胞的分化进行调节［24］。

3 小结

miRNA是生物生命过程中的重要调节分子，所以研究miRNA与骨疾病特别是miRNA与骨质疏松症的关系，对口腔种植的发展具有重要的意义。随着对miRNA作用机制的深入研究，人们对高等真核生物基因表达调控的了解将会达到更高的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。

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