抗热应激复方中药制剂中部分活性成分含量的测定

张晓婷，陈光英，宋鑫明，张锦辉，陈 忠*

（1.海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

抗热应激复方中药制剂中部分活性成分含量的测定

张晓婷1，陈光英2，宋鑫明2，张锦辉1，陈 忠1*

（1.海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158；2.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571158）

为建立测定复方中药制剂总黄酮、多糖含量的方法，采用试管法对黄酮进行定性鉴定，紫外分光光度法测定总黄酮、多糖含量.结果显示试管法检测黄酮粗提取物中含有黄酮类化合物或其苷类，400～800 nm波长扫描测得最大吸收峰在510 nm，紫外分光光度法测定时，测得芦丁对照品在4～40 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.994 1），平均回收率为98.43%RSD=1.20%；苯酚-硫酸法测得葡萄糖对照品在1.4～7.1 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.998 3）；3，5-二硝基水杨酸法测得葡萄糖对照品在7.7～38.5 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.986 4）.所用方法简便、准确、稳定、重现性好，可用于抗热应激复方中药制剂中黄酮、多糖含量的测定.

复方中药制剂；黄酮；多糖；含量测定

中药是我国遗传下来的一大宝藏，其资源丰富.近年来，一些补中益气、清热解暑的中药不断的被作为抗热应激药物研究，如：香芪四君子汤[1]、女贞子、五味子[2]、穿心莲[3]、复合人参制剂[4]等.但中草药所含成分复杂多样，为了使其作用机制更加明确，对其有效成分的提取及含量测定成为开发中草药的一种重要途径.

黄酮类化合物在自然界分布广泛，具有生物抗氧化性，清除自由基，抗衰老，治疗心脑血管疾病，降血脂，降血压，降低血糖，治疗慢性前列腺炎，抗肿瘤等作用[5].在抗热应激方面，一些研究表明黄酮可以缓解热应激引起的氧化应激，使抗氧化酶类活性升高，总抗氧化能力提高[6-9].另外，Chang[10]研究表明，静脉注射黄芩苷可使热暴露大鼠体温、颅内压显著降低，NO2-、谷氨酸盐、丙三醇、乳酸盐以及下丘脑中的DHBA含量升高，缓解肾损伤与肝损伤，因此黄芩苷可以作为治疗中暑的预防性药物.对于黄酮类化合物抗热应激机制的研究，Hosokawa[11]研究表明槲皮素可与热激因子相互作用，抑制该因子的活化从而使该因子不能与热激元件发生结合，阻断热损伤的传导过程.

中药中的多糖较多，有些不具有生物活性，而有些多糖却是中药活性成分之一，如人参多糖、黄芪多糖、麦冬多糖等.近年来中药多糖在提高免疫力、抗肿瘤、抗病毒以及对烫伤的治疗等方面都有所研究与进展[12]，为了更好的开发我国的中草药药材，本试验对一种具有抗热应激作用的复方中药制剂的部分活性成分进行提取与含量测定，希望对以后的进一步研究提供一定数据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

根据中药理论上“君、臣、佐、使”的理论，本室研制的由金银花、黄芪、麦冬、五味子、白花蛇舌草、柴胡6种药材伍配成的抗热应激复方中药制剂，其中金银花、黄芪、白花蛇舌草产于广西，五味子、柴胡产于云南，麦冬产于四川.

1.1.2 主要仪器与试剂

旋转薄膜蒸发仪（日本东京理化，N-1100D-W），分析天平，冷冻离心机，紫外可见分光光度计.芦丁标准品，乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，盐酸，镁粉，碱式醋酸铅，sevage试剂，葡萄糖，3，5-二硝基水杨酸，酒石酸钾钠，亚硫酸钠，苯酚，浓硫酸，上述试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 复方中药制剂中黄酮类物质的提取

将复方中药常规水煮，浓缩，95%乙醇溶解浓缩液，使溶液中乙醇最终浓度为80%，静置过夜，过滤，取上层清液浓缩，按1∶20比例，用60%乙醇溶解浓缩液，得到1∶1（每mL溶液含1 g生药）黄酮粗提取物，4℃保存备用.

1.2.2 黄酮的定性鉴定

参考植物化学研究一般方法[13]，利用盐酸+镁粉显色反应和碱式醋酸铅沉淀反应对黄酮粗提取物溶液进行定性鉴定.

1.2.3 黄酮粗提取物最大吸收波长的确定

取芦丁标准品溶液与黄酮粗提取物溶液皆0.5 mL，分别置于2支试管中，按“1.2.4”方法显色，以等量的60%乙醇作空白，显色后，标准溶液与供试溶液分别于400～800 nm扫描，确定其最大吸收波长.

1.2.4 芦丁标准曲线的绘制

分别取0.2 mg/mL的芦丁标准液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0 mL置于8个25 mL的容量瓶中，加入0.7 mL 5%NaNO2摇匀，放置5 min后加入0.7 mL 10%Al（NO）3混匀，5 min后加入5 mL 4%NaOH混匀，用60%乙醇稀释至刻度，10 min后测定波长吸光值.以吸光值为横坐标，溶液浓度（μg/mL）为纵坐标绘制标准曲线.

1.2.5 精密度试验

取0.05 g/mL的黄酮粗提取物0.5 mL，按“1.2.4”方法显色，连续测定5次.

1.2.6 稳定性试验

分别取0.2 mg/mL的芦丁标准液与0.05 g/mL的黄酮粗提取液皆0.5 mL，按“1.2.4”方法显色，于室温中分别放置6、20、45 min，测其吸光值.

1.2.7 重复性试验

取0.5 mL 0.05 g/mL的黄酮粗提取液3份，按“1.2.4”方法显色，测溶液吸光值.

1.2.8 待测样品中黄酮含量的测定

重复取3份0.05 g/mL黄酮粗提取液0.5 mL于25 mL的容量瓶中，按“1.2.4”方法显色，测吸光值，通过回归方程与相应转换公式计算黄酮含量.

1.2.9 黄酮回收率试验

采用加样回收法，重复取4份0.05 g/mL的黄酮粗提取液0.5 mL加到25 mL容量瓶中，然后再向容量瓶中分别加入0.2 mg/mL芦丁标准液0.4、0.8、1.0、2.0 mL，分别显色后测吸光值，计算黄酮回收率.

1.2.10 复方中药制剂中多糖的提取

将复方中药常规水煮，浓缩，用95%乙醇溶解浓缩液，使溶液中乙醇最终浓度为80%，静置过夜，过滤，用水溶解沉淀，sevage法除蛋白，合并上清液浓缩，得到1∶1（每mL溶液含1 g生药）粗糖提取物，4℃保存备用.

1.2.11 粗糖提取物中多糖含量的测定

将粗多糖提取液按1∶60稀释，采用苯酚-硫酸法[14].

1.2.12 粗糖提取物中还原糖含量的测定

将粗多糖提取液按1∶3稀释，采用3，5-二硝基水杨酸法[14].

1.2.13多糖含量的测定

多糖=总糖-还原糖.

2 实验结果

2.1 黄酮的定性鉴定

盐酸+镁粉反应试验结果表明，加入镁粉的试管显酱红色，不加镁粉不显红色.碱式醋酸铅沉淀试验结果表明，溶液变浑浊，有沉淀生成.这表明样品中含有黄酮或其苷类物质.

2.2 最大吸收波长的选择

400～800nm波长扫描结果显示，芦丁标准溶液与黄酮供试样品在510 nm左右均具有最大吸光值，可以确定510 nm为检测波长，光谱扫描曲线见图1.

图1 标准液与样品液光谱扫描图Fig.1 The spectral scanning of standard solution and sample solution

2.3 芦丁标准曲线的线性考察

在510nm波长下测定吸光度，以吸光值为横坐标，溶液浓度（μg/mL）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：Y=84.304X+0.769，r=0.9941，表明吸光值与溶液浓度正相关，芦丁在4～40 μg/mL线性关系良好.

2.4 稳定性及加样回收率试验结果

芦丁标准品溶液与供试品溶液RSD分别为0.12%、0.07%，这表明芦丁标准品溶液与黄酮供试品溶液在45min内稳定.黄酮粗提取物中总黄酮含量为20.83 μg/mg，RSD=1.51%，该结果说明该方法的回收率良好，结果可靠.另外，从表1可知，黄酮粗提取物中总黄酮回收率为98.43%，RSD为1.20%.

表1 黄酮回收率试验结果（n=4）Tab.1 The test results of flavonoids recovery(n=4)

2.5 黄酮粗提取物、粗糖提取物中总糖、还原糖和多糖含量的测定结果

根据芦丁标准曲线与相关计算公式获得黄酮粗提取物中总黄酮含量为20.83 mg/g（每克生药中所含黄酮量）.利用苯酚-硫酸法测得葡萄糖的标准曲线方程为：Y=16.317X-1.336，r=0.9983.根据标准曲线方程与相应换算公式计算得粗多糖提取物中总糖含量是337mg/g（每克生药中所含还原糖量）.利用3，5-二硝基水杨酸法测得葡萄糖标准曲线方程为：Y=63.106X+0.418，r=0.9864.根据标准曲线与换算公式计算得粗糖提取物中还原糖含量为3.434 mg/g（每克生药中所含还原糖量）.据“多糖=总糖-还原糖”计算得粗多糖提取物中多糖的含量为3.903 mg/g（每克生药中所含多糖量）.

3 讨论

中草药提取成分中含有多种苷类、多糖、生物碱、有机酸、挥发性成分等，这些成分往往是中草药中的有效成分.而中草药中总黄酮的含量测定成为近年来关注的焦点[15].中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色谱法等[16].比色法是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法常用[17].这种方法以NaNO2-Al（NO3）3为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征，以芦丁为对照，在510 nm处测定吸光度，从而得到待测物质总黄酮的含量.本实验采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定，结果显示该法快速、准确，重复性、稳定性、精确性好等特点.

多糖为大分子物质，传统观念认为多糖生理活性不强，在中草药提取制备过程中常将多糖作为杂质除去.自20世纪70年代以来陆续发现多糖及多糖复合物参与了细胞生命的代谢和调节，中草药多糖在增强机体免疫功能及抗肿瘤、抗肝炎、抗溃疡、调血脂、降血糖、抗衰老方面有作用[18-20].因此，在对中草药研究过程中，多糖含量亦应受到关注.目前常用的多糖含量测定方法为比色法、滴定法和HPLC法，其中比色法中的苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法应用最广，且钟方晓[21]在比较该两种比色法时发现苯酚-硫酸法较蒽酮-硫酸法稳定，因此本实验采用苯酚-硫酸法检测多糖含量.复方中药制剂所含成分复杂，硫酸显色作用广泛，因此本实验用sevage法去除蛋白的干扰，该方法条件温和，不会引起多糖变性，且为了去除还原糖的干扰，用DNS法测定还原糖含量，使多糖含量测定更准确.

本试验只是对该复方中药的部分活性成分进行含量测定，复方中药中成分与作用机制复杂，因此其它有效活性成分的检测以及成分与药效之间的关系还有待于进一步的研究.

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Determination of the Content of Active Ingredients in the Anti-heat Stress Compound Chinese Medicine Preparation

ZHANG Xiaoting1，CHEN Guangying2，SONG Xinming2，ZHANG Jinhui1，CHEN Zhong1＊
（1.College of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou571158，China；2.College of Chemisry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou571158，China）

To establish the content determination method for total flavonids and polysaccharides in the compound Chi⁃nese medicine preparation,a qualitative detection of the flavonoids was conducted by the tube method,while the content of total flavonoids and polysaccharides was determined by UV spectrophotometry.The determination result showed that there were flavonoids or glycosides in the crude extract of flavonoids as determined by tube method.The maximum ab⁃sorption value was at 510 nm by 400～800 nm spectral scanning.The linear relation of the tutin control was good within the range of 4～40 μg/mL at the maximum wavelength(r=0.994 1).The average recovery was 94.83%and RSD was 1.20%.The linear relation of the glucose control was good within the range of 1.4～7.1 μg/mL,determined by phenol-sul⁃furic method(r=0.998 3).The linear relation of the glucose control was good within the range of 7.7～38.5 μg/mL,deter⁃mined by 3,5-dinitrosalicylic acid(r=0.986 4).To conclude,the method is simple,accurate,stable and has good repro⁃ducibility,which can be used to detect the total flavonoids and polysaccharides in the anti-heat stress compound Chi⁃nese medicine preparation.

the compound Chinese medicine preparation；flavonoid；polysaccharide；content determination

R 284.2

A

1674-4942（2011）01-0081-04

2010-11-20

海南省科技厅项目（080208，30817）；国家农业科技成果转化基金项目（2010GB2E200385）

*通讯作者

黄 澜