PGPR芽孢杆菌B－1菌株的鉴定及其应用效果

张爱民，张双凤，赵钢勇，张瑞英

（1.河北大学生物技术研究中心，河北保定 071002；2.河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

PGPR芽孢杆菌B－1菌株的鉴定及其应用效果

张爱民1，张双凤1，赵钢勇1，张瑞英2

（1.河北大学生物技术研究中心，河北保定 071002；2.河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

从国外产品中分离得到一株PGPR菌株，编号为B－1；观察了该菌株的形态大小和菌落形态，进行了生理生化反应，通过热变性法测定其G＋C（鸟嘌呤－胞嘧啶）摩尔分数为47.2%，鉴定该菌株为短芽孢杆菌（Bacillusbrevis）；通过小麦水培实验研究了该菌株对小麦株高和鲜重的影响，地上部鲜重较对照增加10.64%，株高较对照增加6.75%；玉米盆栽实验证实该菌株实验效果优于胶质芽孢杆菌菌株，株高较对照增加8.0%，叶面积增加5.6%.

筛选分离；短芽孢杆菌；小麦水培实验；玉米盆栽实验

随着生态农业的发展，各国都在积极应用和研究无污染、无公害的生物肥料，世界上已有70多个国家进行生物肥料的生产.我国为一农业大国，农业在国民经济中占有重要地位［1］，目前由于农民过度地依赖化学农药和化学肥料，造成有机肥用量不足，土壤盐分失调，土地板结，土壤质地下降，河流和地下水污染等一系列问题［2］，影响我国农业的可持续发展.因此开发和分离筛选新的PGPR微生物肥料菌株［3］，成为广大微生物科研工作者的责任.

微生物肥料的应用已被证明是农业可持续发展的有效途径，是生产绿色食品的重要内容，我国在无公害蔬菜的生产规范中已将生物肥料列入推荐用肥.目前微生物肥料在多种作物上得到广泛应用，并取得了良好的经济效益和社会效益［4］.印度Krisnna Bioprodut公司是专业生产微生物肥料的公司，其产品在印度的许多作物上得到广泛应用，如芒果、水稻、小麦等，并取得了良好的增产效果，粮食作物在5%左右，经济和水果类作物达到10%以上.

本研究选用的菌株为作者从印度Krisnna Bioprodut公司的生物肥料产品中分离筛选出的一株PGPR菌株，编号B－1，通过形态观察和生理生化反应，对该菌株进行了鉴定；通过小麦水培实验和玉米盆栽实验，发现该菌株对小麦和玉米的促生作用优于胶质芽孢杆菌菌株［5］，而胶质芽孢杆菌作为生产菌株在我国的很多肥料生产企业中已经国家农业部进行了登记，并在多种作物上取得了很好的增产作用［5］.因而，本研究为所分离的菌株作为微生物肥料生产菌株提供了理论依据.

1 材料和方法

1.1 菌种来源

从印度Krisnna Bioproduct公司的产品中分离.

1.2 培养基

1.2.1 分离培养基

牛肉膏5.0 g／L，蛋白胨10.0 g／L，NaCl 5.0 g／L.

1.2.2 生孢培养基

蛋白胨0.7 g，牛肉膏5 g，酵母膏1 g，MnSO4·H2O 50 mg，蒸馏水1 000 m L，琼脂18 g.

1.3 方法

1.3.1 菌株分离方法

取Krisnna Bioproduct公司的产品10 g，无菌操作放入100 m L带有玻璃珠的无菌水中，在康氏振荡器上振荡40 min，然后100℃水浴3 min，采用稀释平板法稀释到0.001 g／L，取0.1 m L涂布在分离培养基平板上［5］，30℃培养48 h后，进行结果观察和挑取菌落，记作B－1，并保存在生孢培养基斜面上.

1.3.2 菌株鉴定方法

1.3.2.1 菌体形态和菌落形态观察 在B－1保存菌株斜面上挑取菌苔少许，涂在载玻片上，染色后观察菌体形态；将B－1保存菌株在分离培养基平板上划线，观察单个菌落的形态特征.

1.3.2.2 生理生化鉴定 依据一般细菌的鉴定方法进行过氧化氢酶活性、需氧性、乙酰甲基甲醇实验（V.P.实验）、碳水化合物产酸（包括从葡萄糖产气）、酪素水解、淀粉水解、酪氨酸水解、柠檬酸盐和丙酸盐的利用、硝酸盐还原、生长温度和耐盐性的测定.

1.3.2.3 G＋C（鸟嘌呤－胞嘧啶）摩尔分数的测定 采用温度热变性法［6］测定.

1.4 小麦水培实验

采用平皿滤纸培养法，以胶质芽孢杆菌作为对照菌株，每皿均匀摆放25粒种子，按照每粒种子表面接种的菌数为106的标准进行接种实验，设3个处理，4次重复，处理1：B1菌株；处理2：胶质芽孢杆菌菌株；处理3：清水对照.室内光照培养，每天10 h光照，20 h暗培养，随机排列.35 d后进行调查和结果分析.

1.5 玉米盆栽实验

挑选大小一致的花盆9个，每盆装1.75 kg土，分3层装入花盆，分别压实，定植玉米种子，每盆8粒，在每粒种子表面点加0.2 m L菌液或水，最后表面覆盖0.75 kg土，压实.本实验设3个处理，3次重复，随机排列.处理1：B－1菌株；处理2：胶质芽孢杆菌菌株；处理3：清水对照.

将所有花盆放在通风良好、光照均匀处，种子发芽前2天浇1次水，每盆200 mL左右，水量要求一致.进入玉米苗期后，每天浇水1次.待幼苗长至第1片叶展开后，进行疏苗，选取长势相近的幼苗，每盆留苗6株，本实验周期为55 d，测定项目为玉米的株高和叶面积.玉米植株株高的测定方法为测量从根与茎的结合部到最高叶片的顶端，玉米叶面积测定方法为测量第4叶的长度和宽度（最宽处），依据长度和宽度的乘积计算叶面积.

2 结果和讨论

2.1 B－1菌株的菌体形态和菌落形态

B－1菌在肉汤平板上生长，营养体早期为两联，随后断落为单个菌体.单个菌体形态为细杆状，营养体中后期，中部开始膨大，呈纺锤状，芽孢在膨大部位形成，由小变大，形成孢子囊，孢子囊脱落释放出芽孢，整个过程48 h完成.B－1菌株革兰氏染色结果为可变，大小为（2.5～4.0）μm×（0.6～0.9）μm.B－1菌株在肉汤平板上菌落形态为表面有金属光泽，边缘整齐，灰白色，微凸起，圆形，不透明，培养48 h，直径2～5 mm.结果见图1和图2.

图1 B－1菌株的菌落形态Fig.1 Shape of B－1 clony

图2 B－1菌株的菌体和芽孢形态 Fig.2 Shape of B－1 cell and spore

2.2 B－1菌株的生理生化反应

B－1菌株的14项生理生化反应结果见表1.

表1 B－1菌株的生理生化实验结果Tab.1 Results of physiological and biology－chemical reaction

2.3 G＋C摩尔分数的测定结果

采用温度热变性法，以标准菌株大肠杆菌（E.coli.K12）为参比菌株，测定B－1菌株的G＋C摩尔分数，大肠杆菌K12菌株的tm值为74.9℃，B－1菌株的tm值为74.2℃，依据G＋C摩尔分数＝（tm－53.9）／0.41经验公式计算，E.coli.K12菌株的G＋C摩尔分数为51.2%，B－1菌株的G＋C摩尔分数为47.2%，见图3和图4.

2.4 鉴定结果

参照伯杰氏细菌鉴定手册［7］和CRC微生物手册［8］，依据B－1菌株的菌体形态特征和菌落形态，并参照其生理生化反应和G＋C摩尔分数，将该菌株鉴定为短芽孢杆菌（Bacillusbrevis）.

图3 E.coli K12菌株温度热变性曲线Fig.3 Curve of thermal denaturation of E.coli K12

图4 B.brevis B－1菌株温度热变性曲线Fig.4 Curve of thermal denaturation of B.brevis B－1

2.5 小麦水培实验结果

小麦定植后，生长35 d后，将植株和麦粒用剪刀剪开，测定地上部分鲜重，并且从每皿中取出10株测定植株的高度，结果见表2，3.

表2 小麦植株地上部鲜重测定结果Tab.2 Result of f resh weight of wheat stem and leaf

表3 小麦植株株高测定结果Tab.3 Result of wheat height

从表2和表3可以看出，本研究新分离的B－1菌株和胶质芽孢杆菌均对小麦的生长发育具有刺激作用，地上部分鲜重胶质芽孢杆菌较对照增加1.10%，B－1菌株较对照增加10.64%；株高B－1菌株较对照增加6.75%，说明新分离的B－1菌株可以提高小麦的株高和地上部分鲜重，对小麦的生长发育具有刺激作用.

2.6 玉米盆栽实验结果

6株玉米的叶面积测定结果见表4.

表4 玉米叶面积Tab.4 Maize leaf area cm2

从表4看出，接种B－1菌株和胶质芽孢杆菌均能促进玉米生长发育，B－1菌株叶面积较对照增加5.6%.盆栽玉米实验进行苗期调查，株高结果见表5.

表5 玉米株高Tab.5 Maize plant height cm

玉米接种B－1菌株和胶质芽孢杆菌平均株高均较对照高，B－1菌株较对照增加8.0%，而胶质芽孢杆菌较对照增加1.7%.

3 结论

1）通过菌体和菌落形态观察及相关生理生化实验，依据伯杰氏细菌学鉴定手册，鉴定从印度Krishna Bioproduct产品分离的B－1菌株为短芽孢杆菌.

2）B－1菌株具有促进作物生长发育之功效，小麦水培实验表现为小麦植株株高和鲜重均比对照和参比菌株增长效果明显，株高较对照增加6.75%，鲜重较对照增加10.64%；玉米盆栽实验证实玉米接种B－1菌株和胶质芽孢杆菌均能促进其生长发育，而B－1菌株优于胶质芽孢杆菌菌株，叶面积较对照增加5.6%，株高增加8.0%.

3）菌株的代谢产物及其增产机理有待进一步探索.

4）B－1菌株的作物应用试验有待进一步扩大.

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Applied Effects and the Identification of PGPRBacillusB－1 Strain

ZHANG Ai－min1，ZHANG Shuang－feng1，ZHAO Gang－yong1，ZHANG Rui－ying2
（1.Center of Biological Technology，Hebei University，Baoding 071002，China；2.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

A PGPR strain named B－1 was separated from foreign products，the morphology of the cell and the clony was observed and physiological and biology－chemical reaction were made.DNA G＋C mol% was 47.2%by the method of thermal denaturation，so the strain was identified asBacillusbrevis；The height and the fresh weight was studied by the experiments of wheat inoculated with it.The fresh weight of wheat was increased by 10.64%and the plant height was increased by 6.75%.The maize pot experiment results showed that significant increasing effect could be got，plant height and leaf area could be increased than that of the control andBacillusmucilaginosus.Maize plant height could be increased by 8.0%and the leaf area could be increased by 5.6%.

separation；Bacillusbrevis；wheat water experiment；maize pot experiment

Q 93－331

A

1000－1565（2011）03－0294－05

2010－03－21

河北省科技支撑项目（062071250－2）

张爱民（1967－），男，河北保定人，河北大学副研究员，河北农业大学在读博士，主要从事农业微生物研究.E－mail：zhangam2008＠yahoo.com.cn

赵藏赏）