老年低额溞卵黄蛋白的分离纯化及性质

郭艳敏，谢松，柳峰松，赵丽坤，赵海

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定学院 生物系，河北 保定 071000）

老年低额溞卵黄蛋白的分离纯化及性质

郭艳敏1，谢松1，柳峰松1，赵丽坤1，赵海2

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.保定学院 生物系，河北 保定 071000）

为了研究老年低额溞卵黄蛋白（vitellion，Vn）在环境检测中的应用，采用制备电泳方法，从老年低额溞整体匀浆液提取的粗蛋白中纯化其Vn.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测表明，SephadexG-100得不到高纯度的Vn，制备电泳可以得到高纯度的Vn，达到了实验要求.对老年低额溞Vn的性质进行研究，老年低额溞Vn总分子质量为389 900 u，含有5种亚基，分子质量分别为76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u，含有2个二硫键，等电点为5.0～5.5，是一种酸性蛋白.

老年低额溞；卵黄蛋白；层析；制备电泳

1954年 Telfer［1］发现了雌性特异蛋白（female specific protein，FSP），1969年 Pan［2］等命名此蛋白为卵黄蛋白（vitellin，Vn）.现已确认Vn是一种高密度糖脂蛋白，是卵生非哺乳动物体内一种雌性特异蛋白［3］，存在于成熟雌性个体的卵中［4］.

近年来对于鱼类卵黄蛋白原在环境检测方面的研究较多［5-7］，此外Lee等［8］还克隆了日本虎斑猛水蚤卵黄蛋白原的启动子，发现其启动子区不但含有雌性激素应答元件，还含有一个金属应答元件，可以受到重金属镉的诱导调控.经济合作与发展组织已经将卵黄蛋白原作为环境雌激素化学物理想的暴露标志物［9］，卵黄蛋白原是Vn前体，在卵巢发育后期，被卵巢中的卵母细胞吸收后经剪切修饰转化成Vn［4］.

老年低额溞是一种小型甲壳类动物，繁殖速度快，一般5～8 d就能达到性成熟，其卵黄蛋白原很快转化成Vn；另外老年低额溞又是一种较低级的水生生物，对环境污染物的刺激比较敏感［10］，所以其Vn很容易受水体环境的影响.目前对于像枝脚类这类小型甲壳动物的Vn研究较少.老年低额溞分布广泛，是环境监测的理想材料，对其Vn进行纯化具有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 实验材料

2010年9月于保定市护城河捞取混合溞类，在实验室进行纯培养，纯化得到老年低额溞.

1.2 实验方法

1.2.1 粗蛋白的制备

将老年低额溞从鱼缸捞出，冲洗干净，吸干其表面的水.用4倍体积的0.02 mol／L，p H 8.0的Tris-HCl缓冲液混合后放入研钵中研磨，8 000 r／min离心10 min，弃沉淀，取上清液于-20℃冰箱保存备用.

1.2.2 Vn的鉴定

银染色：专门挑选无卵的老年低额溞，提取其粗蛋白，与有卵老年低额溞的粗蛋白天然-PAGE比较，电泳结束后用银染色［11］.

高碘酸-Schiff试剂染色［12］：采用天然-PAGE，电泳结束后用高碘酸-Schiff试剂染色.

饱和乙酰苏丹黑染色［12］：将粗蛋白与饱和乙酰苏丹黑以体积比10∶1混合，置37℃水浴保温30 min，再与400 g／L蔗糖1∶1混合后进行电泳.

1.2.3 Vn的纯化

凝胶过滤层析法［13］纯化 Vn：将SephadexG-100用0.01 mol／L，p H 7.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡后，取0.5 m L粗蛋白上柱，同种缓冲液进行洗脱，流速为13.3 m L／h，收集各洗脱峰，透析浓缩，以天然-PAGE检测Vn.

制备电泳法［4］纯化Vn：制备电泳中浓缩胶质量浓度为36 g／L，分离胶质量浓度为45 g／L，回收后用天然-PAGE检测其纯度.

1.2.4 Vn的性质总分子质量的测定：纯化的Vn采用梯度电泳［14-15］测定其总分子质量，梯度胶质量浓度为40～150 g／L.亚基数目及其分子质量的测定：采用SDS-PAGE法［16-18］.

二硫键数目的测定：采用SDS-PAGE法，巯基乙醇用于二硫键的还原，用含有巯基乙醇的样品缓冲液和不含巯基乙醇的样品缓冲液分别电泳［16］，比较两者亚基数目.

等电点测定：用聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳［19］测定Vn的等电点.

2 实验结果

2.1 Vn的鉴定

2.1.1 银染色

图1显示，有卵老年低额溞比无卵老年低额溞明显多出1种蛋白组分，并且该组分含量丰富.由于Vn只存在于动物的卵内，且是卵黄的主要成分，在无卵动物体内并不存在［4］，另参照 Quinitio［20］等相关研究，可确定该蛋白组分为Vn.

2.1.2 高碘酸-Schiff试剂染色和饱和乙酰苏丹黑染色

由图2可知，Vn可同时被高碘酸-Schiff试剂和饱和乙酰苏丹黑着色，说明是一种糖脂蛋白，与已经发现的其他动物的Vn该项性质相符［4，16］.

图1 银染色Fig.1 Silver staining

图2 高碘酸-Schiff试剂染色和饱和乙酰苏丹黑染色Fig.2 Dyeing by periodic acid-Schiff and saturated acetyl sudan black

2.2 Vn的纯化

粗蛋白经Sephadex G-100层析，得到2个洗脱峰（图3），天然-PAGE检测2个洗脱峰都含有Vn，且每个洗脱峰都不止含有Vn，电泳图谱上位置离Vn接近的蛋白组分在2个洗脱峰中也都含有（图4），可见经Sephadex G-100层析不能得到高纯度的Vn.后将粗蛋白进行制备电泳，将回收的Vn透析浓缩，天然-PAGE检测，结果显示能得到较纯的Vn（图5）.

图3 凝胶过滤层析法分离老年低额溞VnFig.3 Gel filtration chromatography separating Simocephalusvetulus'vitellion

图4 凝胶过滤层析各洗脱峰蛋白PAGE电泳Fig.4 PAGE of protein in two elutionpeaks of gel filtration chromatography

图5 制备电泳所得蛋白PAGE电泳Fig.5 PAGE of protein from preparative electrophoresis

2.3 Vn的性质

2.3.1 Vn总分子质量和各个亚基分子质量的测定

梯度电泳测得Vn的总分子质量为389 900 u（图6 a）；SDS-PAGE结果显示，使用巯基乙醇的泳道比没有使用巯基乙醇的泳道多出2个亚基，因此Vn含有2个二硫键（图6 b）；SDS-PAGE法测得Vn含有5种亚基，各亚基的分子质量为76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u（图6 c）.

图6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化VnFig.6 PAGE of purified vitellion

2.3.2 等电点的测定

聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定Vn的等电点为5.0～5.5，是一种酸性蛋白.

3 讨论

老年低额溞是一种小型甲壳动物，最大的体长只有2～3 mm，卵粒更小.以往对水产动物Vn的研究大都集中于鱼类，采用直接对卵巢进行研究的方法，对于老年低额溞这种小个体，不宜对其卵巢进行分离，对其整体进行研究，较为便捷.

卵黄蛋白原是Vn的前体，两者都为糖脂蛋白，且荷电性质，分子质量大小等都极为相近.本实验中高碘酸-Schiff试剂染色和饱和乙酰苏丹黑染色时，电泳图谱上位置在Vn上方很近的一种蛋白组分也同时着色（图2），且在有卵与无卵的老年低额溞体内均出现（图1），考虑到卵黄蛋白原通常出现在体液中，推断这一蛋白组分是卵黄蛋白原.

凝胶过滤层析方法按分子质量大小分离蛋白，本实验凝胶过滤层析方法不能分离出Vn；采用制备电泳的方法纯化Vn可得到满意的效果.

本实验证明Vn是一种高分子质量蛋白，同时含有糖基和脂基.有研究证明Vn含有类胡萝卜素［16］，在制备电泳过程中，如果上样量足够大，在没有染色的情况下，就可以在Vn所处的位置看到一条很粗的浅黄色条带，推断这种现象与Vn含有类胡萝卜素有关.

近年来关于Vn亚基的研究报道多集中在鱼类、虾、昆虫等动物.如小体鲟Vn由9个亚基组成［21］；中国明对虾Vn由5个亚基组成［16］；红褐斑腿蝗Vn由7个亚基组成［22］.本实验证明老年低额溞Vn也是一种多亚基蛋白，有5种不同的亚基，但是从总分子质量和各种亚基分子质量总和来看，总分子质量大于各亚基分子质量之和，判断老年低额溞Vn的某些亚基在1个以上.

本实验证明老年低额溞Vn含有2个二硫键，是一种酸性蛋白.

卵黄蛋白原是Vn的前体物质，在卵巢发育后期，被卵巢中的卵母细胞吸收后经剪切修饰，转化成Vn储存在卵中.王浩等对Vn和卵黄蛋白原之间存在的免疫交叉反应的研究，表明Vn和卵黄蛋白原之间具有免疫同源性.根据这一性质，考虑可以通过酶联免疫吸附方法来检测Vn的微量变化［23］，用于评估环境雌激素化学物的影响，老年低额溞Vn的分离纯化和性质研究可为将来在环境评估方面的应用打下基础.

［1］TELFER W H.Immunological studies of insect metamorphosisⅡ：the role of a sex-limited blood protein in egg formation by the cecropia silkworms［J］.J Gen Physiol，1954，37（4）：539-558.

［2］PAN M L，BELL W J，TELFER W H.Vitellogenic blood protein synthesis by insect fat body［J］.Science，1969，165（3891）：393-394.

［3］张士璀，孙旭彤，李红岩.卵黄蛋白原的研究进展［J］.海洋科学，2002，26（7）：32-35.

［4］柳峰松，武金霞，谢松，等.成熟中国对虾卵巢中卵黄蛋白的纯化［J］.河北大学学报：自然科学版，2001，21（4）：406-410.

［5］李康，周忠良，于静，等.鲫鱼（Carassiusauratus）卵黄蛋白原的 ELISA检测［J］.中国环境科学，2003，23（3）：276-280.

［6］邴欣，汝少国，ISODA H，等.17β-雌二醇对雄性金鱼卵黄蛋白原的诱导作用［J］.水产学报，2004，28（3）：236-240.

［7］温茹淑，方展强，江世贵，等.剑尾鱼卵黄蛋白原的ELISA 检测［J］.环境科学研究，2007，20（4）：142-147.

［8］LEE K W，HWANG D S，RHEE J S，et al.Molecular cloning，phylogenetic analysis and developmental expression of a vitellogenin（Vg）gene from the intertidal copepodTigriopusjaponicus［J］.Comp Biocherm Physiol B Biocherm Mol Biol，2008，150（4）：395-402.

［9］HUTCHINSON T H，ANKLEY G T，SEGNER H，et al.Screening and testing for endocrine disruption in fish-bionmarkers as“signposts，”not“traffic lights，”in risk assessment［J］.Environ Health Perspect，2006，114（1）：106-114.

［10］王丹丽，吕明源，林 霞，等.Cu2＋、Zn2＋对老年低额溞的联合毒性试验［J］.浙江海洋学院学报，2001，20（2）：186-188.

［11］汪家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京：科学出版社，2002：93-96.

［12］李建武，萧能庚，余瑞元，等.生物化学实验原理和方法［M］.北京：北京大学出版社，1994：103.

［13］CHANG C F，LEE F Y，HUANG Y S.Purification and characterization of vitellin from the mature ovaries of prawn，Penaeusmonodon［J］.Comp Biochem Physiol，1993，105（2）：409-414.

［14］张龙翔，张庭芳，李令媛，等.生化实验方法和技术［M］.北京：高等教育出版社，1997：119-123.

［15］JIN Jianya，WANG Shigui，XU Caidi，et al.Purification and characterization of vitellin from locustCatantopspinguis（Orthoptera：Catantopidae）［J］.Acta Entomologica Sinica，2008，51（4）：372-378.

［16］谢松，金鑫林，柳峰松，等.中国明对虾卵黄蛋白的部分生化性质［J］.四川动物，2008，27（5）：845-847.

［17］XIE Sie，GUO Chengxiu，LIU Fengsong，et al.Purification and characterization of vitellin in mature ovary of marine crabCharybdisjaponica［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2008，26（2）：162 -165.

［18］MENG Yan，LIU Chaoliang，SHIOMI K，et al.Purification and cDNA cloning of vitellogenin of the wild silkworm，Saturniajaponica（Lepidoptera：Saturniidae）［J］.Journal of Insect Biotechnology and Sericology，2008，77（1）：135-144.

［19］王重庆，李云兰，李德昌，等.高级生物化学实验教程［M］.北京：北京大学出版社，1994：54-60.

［20］QUINTIO E T，HARA A，YAMAUCHI K，et al.Isolation and characterization of vitellin from the ovary ofPenaeusmonodon［J］.Invertebrate Reproduction and Development，1990，17（3）：221-228.

［21］霍堂斌，张颖，孙大江，等.小体鲟卵黄雌性蛋白分离纯化及抗血清的研制［J］.中国水产科学，2007，14（4）：532-539.

［22］金建雅，王世贵，徐彩娣，等.红褐斑腿蝗卵黄蛋白的分离纯化及性质分析［J］.昆虫学报，2008，51（4）：372-378.

［23］谢松，刘哲玉，柳峰松，等.IC-ELISA方法检测中国明对虾幼体卵黄蛋白含量变化［J］.四川动物，2008，27（5）：753.

Purification and Properties of Vitellion FromSimocephalusvetulus

GUO Yan-min1，XIE Song1，LIU Feng-song1，ZHAO Li-kun1，ZHAO Hai2
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Department of Biology，Baoding College，Baoding 071000，China）

In order to study the application ofSimocephalusvetulus'vitellion in the environment testing，from homogenate liquid ofS.vetulus，preparative electrophoresis was used to purify vitellion.Protein was detected by polyacrylamide gel electrophoresis，it indicated that chromatography （Sephadex G-100）couldn't guarantee high-purity of vitellion.Preparative electrophoresis showed that the high purity of the protein could be obtained.Properties ofS.vetulus'vitellion was analysed.Molecular mass of the protein was 389 900 u.Five subunits were found and their molecular mass were 76 500，63 000，59 200，52 700，47 200 u.The protein had two disulfides.Its p I was 5.0～5.5，and it was a acidic protein.

Simocephalusvetulus；vitellion；chromatography；preparative electrophoresis

Q 513

A

1000-1565（2011）06-0643-05

2011-06-28

河北省自然科学基金资助项目（C2010000256）

郭艳敏（1984-），女，河北邯郸人，河北大学在读硕士研究生.

谢松（1964-），男，江西吉安人，河北大学教授，博士，主要从事水生生物学研究.

E-mail：xiesong＠hbu.edu.cn

赵藏赏）