芽孢杆菌乳酸高产菌株UZ-3-15的紫外线诱变选育

李红亚，李术娜，王全，朱宝成

（河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001）

芽孢杆菌乳酸高产菌株UZ-3-15的紫外线诱变选育

李红亚，李术娜，王全，朱宝成

（河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001）

为了获得乳酸的高产菌株，以实验室前期筛选获得的产乳酸芽孢杆菌Z-3-1为出发菌株，通过紫外线诱变来选育乳酸高产菌株.紫外线诱变条件为30W紫外灯，30cm辐照距离，诱变时间为150s.采用溶钙圈法对诱变后的菌株进行初步筛选，得到在MRS-CaCO3培养基上产生透明圈直径较大的菌株19株.通过对菌株的发酵液进行乳酸含量滴定对初筛到的19株菌进行复筛，得到了一株乳酸高产菌株UZ-3-15.在NB培养基中，该菌株产乳酸的能力较出发菌株提高了7倍多.

乳酸高产菌株；芽孢杆菌；紫外诱变；选育

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能发酵糖产生大量乳酸的细菌的统称.除了在食品［1-3］、医疗保健［4-5］等领域内广泛应用外，在畜牧生产中的应用也愈来愈受到关注［6-7］.

乳酸菌是肠道常在菌，它可以改变肠道内环境，抑制有害菌繁殖［8］；调整胃肠道菌群平衡，增强畜禽的免疫抗病能力［9］；可产生消化酶，增强畜禽对饲料的消化吸收能力，提高畜禽的生长速度、奶肉蛋产量和饲料转化利用率［10］.因此乳酸菌可广泛应用于动物饲喂、动物饲料和青储饲料中，对畜牧业生产有重要意义［11］.

本实验室前期筛选得到一株用于玉米秸秆微储的野生型的产乳酸芽孢杆菌Z-3-1，菌株的安全性实验以及生产工艺均已成熟，但是野生型菌株的低发酵能力，使得其在秸秆微储应用中还存在一定问题.为提高其产乳酸能力，促进其在实际生产中的应用，尝试通过紫外诱变的方法对Z-3-1菌株进行选育.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

产乳酸芽孢杆菌Z-3-1：由河北农业大学生命科学学院制药工程系分离、筛选得到.

1.1.2 培养基

NA培养基：每升培养基中含有蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，灭菌前pH调至7.2～7.4.NB培养基：除不加琼脂外其他与NA培养基相同.

MRS培养基：每升培养基中含有蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂20g，灭菌前pH调至6.12～6.2.

MRS-CaCO3培养基：每升培养基中含有10g的碳酸钙，其他配方同MRS培养基.

1.1.3 试剂

氯化钠，轻质CaCO3，浓盐酸，MgSO4·7H2O，EDTA，NaOH，钙羧酸，KOH，乳酸，溴甲酚绿均为分析纯.

1.1.4 主要仪器

SPX-250型智能生化培养箱，宁波海曙赛征试验仪器厂；HW-8B型超级恒温仪，上海浦江分析仪器厂；宁波海曙赛征实验仪器厂；TGL-16M型高速冷冻离心机，湖南赛特湘仪器公司；722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；WH-861型混合器（漩涡振荡器），太仓市科教仪器厂.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

取前期分离、筛选的产乳酸芽孢杆菌Z-3-1斜面1支，在超净台中用灭菌竹签挑取少量菌苔，在酒精灯的保护下挑接到NA斜面培养基上，后将其置于30～35℃培养箱中培养18～24h，4℃冰箱保藏.

1.2.2 制备悬液

1.2.3 紫外诱变的致死率

在诱变超净台中，在30W的紫外灯下放置1个磁力搅拌器，距离为30cm，处理前先开紫外灯稳定20min.吸取10mL菌悬液移入直径6cm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上，打开搅拌开关.关闭可见光源，开启紫外灯的同时开始计时，每间隔30s用移液枪从中吸取1mL菌液.依次将吸出的菌液在红外灯下以10倍稀释法稀释成10-1到10-1010个浓度梯度，取10-8，10-9，10-10浓度梯度的稀释液各70μL涂布于MRS培养基上，避光培养48h后进行单菌落计数并计算致死率，以致死率的大小来确定最佳诱变时间.致死率计算公式为：致死率（%）＝（紫外照射前菌液中活菌数-紫外照射后菌液中活菌数）／紫外照射前菌液中活菌数.

1.2.4 诱变处理

选取合适的处理时间，对Z-3-1菌株进行诱变处理，将10-9，10-102个浓度梯度稀释液涂布于MRS培养基上，30℃下避光培养48h，同时以未经紫外照射的菌液为对照.

1.2.5 MRS-CaCO3初筛

取出培养好的平板，选取长势较好的单菌落，画十字接种到MRS-CaCO3培养基上，于35℃培养72h.取出培养好的MRS-CaCO3平板，观察各菌落周围的溶钙圈大小.挑取透明圈明显大于出发菌株的单菌落，进入复筛.

1.2.6 乳酸滴定

1.2.6.1 发酵液制备 取MRS-CaCO3平板法筛选的菌株，用竹签挑接至NB培养基摇瓶（50mL／250mL），在35℃，200r／min，摇床培养12h后.无菌条件下从每瓶中取适量种子液，分别测定OD600值.根据各自的OD值大小，用灭菌的NB培养基调节各瓶种子液中的菌浓度，保证各瓶种子液的菌浓度一致.随后将种子液按8%接种量接至NB发酵培养基.每株菌2个平行，35℃摇床培养72h.

通过对K1+160—K1+310边坡加固治理前后两阶段定量风险评估结果分析，边坡开挖阶段财产损失风险值Rprop1=552.6万元，加固治理后财产损失风险值Rprop2=4.42万元，边坡治理工程总费用C=229.8721万元。边坡加固治理后的财产损失大幅度降低至可忽略水平。可计算该边坡的工程治理价值为：

1.2.6.2 乳酸含量滴定 将发酵液在5 000r／min下离心8min除菌体.用吸量管吸取30mL上清液加入盛有1.5g CaCO3的250mL锥形瓶中，充分振荡后进行过滤.然后用吸量管吸取20mL滤液加入250mL三角瓶中，最后加入5mL质量分数为6.5%的KOH溶液、30mL水及约10mg的钙羧酸指示剂，用现配的0.02mol／L的EDTA溶液对发酵液进行乳酸含量的滴定，当溶液由红色变为蓝色时即为滴定终点.记录下消耗EDTA溶液的量，选出明显大于原菌消耗量的菌株.

1.2.7 性状遗传稳定性实验

将筛选出的高产菌株传代5次，对最后一代及出发菌株的发酵液进行乳酸含量测定，来确定其高产性状是否能稳定遗传.

1.2.8 发酵产物的纸层析检测

将菌株发酵液在5 000r／min下离心8min除菌体.用毛细管吸取出发菌株Z-3-1及突变株发酵清液在层析纸上点样，重复点4次，以质量分数为2%的乳酸标准品溶液作对照.在展开槽中用V（正丁醇）∶V（甲酸）∶V（水）＝80∶15∶5展开剂进行展开，展开完毕，吹风机吹干，质量分数0.04%的溴甲酚绿（pH 7.6）显色.

2 结果与分析

2.1 诱变剂量的确定

紫外线照射时间对菌株的致死率影响较大，照射时间为60s时致死率为62.7%，当照射180s时达95.4%，如图1所示.据文献报道［12］，一般诱变致死率为80%～90%，容易筛选到变异幅度大的突变菌株，以此为依据确定诱变剂量.选择紫外线照射150s为Z-3-1菌株紫外线诱变剂量，此条件下致死率为90.2%.

图1 Z-3-1菌株在紫外线下照射不同时间的致死率曲线Fig.1 Lethality rates curve of strain Z-3-1in different ultraviolet irradiation time

2.2 MRS-CaCO3 筛选结果

出发菌株Z-3-1的菌悬液经紫外诱变后稀释涂布于MRS培养基上，从MRS培养基上共分离得到78株长势较好的单菌落.再根据MRS-CaCO3培养基的溶钙圈大小对此78株菌进行了初步筛选，从中筛选出19株正突变菌株，结果如图2所示.

图2 MRS-CaCO3 初筛结果Fig.2 Result of MRS-CaCO3

2.3 乳酸滴定结果

对初步筛选出的19株菌分别进行发酵.采用EDTA定钙法对各菌株发酵液中的乳酸进行了含量测定，滴定结果如表1所示.从表1可看出，与出发菌株相比，4株菌的产乳酸量有所提高，分别为UZ-3-4，UZ-3-6，UZ-3-6，UZ-3-8，UZ-3-15，其中 UZ-3-15菌株最为显著，其产乳酸量比出发菌株提高了5.4倍.

表1 乳酸滴定结果Tab.1 Result of the lactic-acid titration

2.4 纸层析结果

为确保突变株的产酸种类未发生变化，对突变株UZ-3-15的发酵液、出发菌株Z-3-1发酵液以及2%标准乳酸溶液进行纸层析.显色后，突变株、出发菌株的发酵液中均显示出与乳酸标准品一致的亮黄色斑点.层析结果如图3所示.

图3 纸层析结果Fig.3 Result of paper chromatogram

2.5 遗传稳定性

经诱变得到的优良菌株UZ-3-15进行5次传代后，将第5代的菌株进行的发酵液乳酸含量测定，消耗滴定液的量仅较第1代消耗的量降低了0.05mL，这表明其性状并未有明显的改变，也就是说本次实验筛选得到的优良菌株的高产性状可以稳定地遗传.

3 讨论

为提高野生型菌株的产乳酸能力，选择常规的紫外线作诱变因子，对前期筛选到的Z-3-1菌株进行了诱变.在紫外灯功率和照射距离固定的情况下，通过改变照射时间来获得不同的诱变剂量，把正变率最高的照射时间确定为最佳诱变剂量，成功地选育出一株高产乳酸的突变菌株UZ-3-15，经过5次传代后，其乳酸高产性状保持稳定.

诱变处理完成后，在分离、筛选正突变菌株的环节中，为了减少工作量，将诱变菌株的分离及富集培养有机结合在一起.针对性地选择MRS培养基作为诱变后的富集培养基，从中筛选出长势良好的菌株作为初筛对象，大大减少了工作量.

种子液接种量直接影响菌株发酵产物的产量，因此在正突变株复筛的发酵培养过程中，应严格控制各菌株发酵液中种子液接种量，确保各菌株发酵液的种子液接种量一致.本研究中以种子液OD值为参照，用灭菌后的发酵培养基来调节菌浓度，使种子液的菌浓度一致.在保证了各菌株发酵液中种子液接种体积相同的情况下，接入的菌量也基本相等，从而防止了因接种量的不一致而造成正突变株的筛选误差.

综上所述，本研究通过紫外诱变结合高效易行的筛选方法，选育出高产乳酸的突变菌株UZ-3-15，且该菌株的遗传稳定性良好.

［1］刘进杰，王淑芳，冯志彬，等.固定化乳酸菌发酵番茄饮料工艺研究［J］.食品工业科技，2008（7）：76-79.

［2］李宏高，吴忠会，刘侠，等.灵芝、南瓜乳酸菌饮料的研制［J］.食品工业科技，2008，29（7）：157-159.

［3］李昀，刘漪.乳酸菌发酵淡水鱼骨泥制备高钙饼干的研究［J］.食品科技，2008（7）：98-100.

［4］金德华，叶光荣，向贵英.大剂量乳酸菌素片保留灌肠治疗小儿腹泻病疗效观察［J］.海南医学，2008，19（7）：51-52.

［5］余丽芸，王桂华，唐彦君.乳酸菌作为口服疫苗载体的研究进展［J］.生物技术通报，2008（5）：48-50.

［6］刘晗璐，桂荣，塔娜.乳酸菌添加剂对禾本科混合牧草青贮发酵特性的影响［J］.畜牧兽医学报，2008，39（6）：739-745.

［7］刘静，张日俊.乳酸菌在畜牧生产中的开发与应用［J］.中国动物保健，2005，35（4）：34-36.

［8］马治宇，赵献军，张晓庆，等.乳酸菌及其培养液对肉鸡盲肠菌群的影响［J］.西北农业学报，2008，17（3）：33-36.

［9］谢红兵，常新耀，王永强.乳酸菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响［J］.安徽农业科学，2008，36（24）：10468-10469.

［10］李济宸，李群.益生康菌剂发酵秸秆生产猪饲料技术［J］.科学种养，2006（11）：43.

［11］王蔚淼，张家学，齐振雄.乳酸菌类微生态制剂在饲料中的应用［J］.饲料博览：技术版，2008（7）：8.

［12］诸葛健.工业微生物实验技术手册［M］.北京：中国轻工出版社，1994.

Breeding of Lactic Acid High ProducingBacillusUZ-3-15 by UV Mutation

LI Hong-ya，LI Shu-na，WANG Quan，ZHU Bao-cheng
（College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China）

In order to obtain lactic acid high producing strains，the study usedBacillusZ-3-1which was obtained before as original strain for stepwise mutation by UV irradiation was carried out.Conditions for mutagenesis were 30WUV lamp，30cm irradiation distance and irradiation dose of 150s.In the experiment，the preliminary screening of mutant strains was implemented first through calcium-dissolving，and 19strains with bigger transparent circle diameters in the MRS-CaCO3medium were obtained in the preliminary screening.Then the secondary screening of 19strains was done，and one lactic acid high producing strain named UZ-3-15was obtained by the titration method for determination of lactic acid in the fermented broth，which produced 7times more lactic acid than its parent strain in the NB medium.

lactic acid high producing strain；Bacillus；UV mutation；breeding

Q 933

A

1000-1565（2011）06-0627-05

2011-03-20

国家星火计划项目（2010GA620010）；河北省农业科技成果转化基金项目（09825125D）

李红亚（1977-），女，河北蠡县人，河北农业大学讲师，在读博士，主要从事农业微生物学研究.

朱宝成（1963-），男，河北沧州人，河北农业大学教授，博士生导师，主要从事农牧微生物学研究.

E-mail：zhu2222＠126.com

赵藏赏）