微生物改良法测定红细胞叶酸研究

张春芳

(丹阳市第二人民医院,江苏丹阳 212300)

血液当中的叶酸水平比较低的原因很多,与叶酸缺乏巨幼细胞贫血有关系,与胎儿神经管的缺陷有关系,可以影响血管的功能,增加卒中的危险,所以血液当中叶酸水平的检测应受到高度重视。本文主要用微生物改良法来测定红细胞叶酸。

1 资料与方法

1.1 一般资料

测量液:2.40g培养基,0.02g氯霉素,0.11gVC,0.11mL Tween-80,100mL去离子水进行配置,每单位5mL进行分装。

保养液:在每升测量液当中添加10mL的标准叶酸,然后每单位5mL分装保存到无菌带塞试管中,在-20℃的环境中可以保存1年(标准的叶酸浓度为10ng/mL)。

菌株的制备:耐氯霉素乳酸菌冻干菌株。把冻干的菌株悬浮在5mL保养液上面,在温度为36℃的环境下孵育18h,然后取一滴混匀的液体当中加入5mL保养液,在36℃的环境当中孵育18h以后,取0.5mL加入 5mL的保养液,在36℃的环境下孵育6h后用生理盐水清洗5次,然后用5mL生理盐水悬浮。

经过测定样本得到:高值质控标准为2.3ng/mL,低值质控标准为1.8ng/mL。分装以后保存在-70℃的环境当中,要保证质控标准只冻融一次。患有不同疾病的患者50例以及健康人员25例,年龄2～39岁。所有的患者都需要空腹,采取3～4mL的肘静脉血,放在干燥管内,按照1∶10的比例在1%的VC液当中稀释,然后贮存在-20℃的环境当中。

1.2 方法

把试管放在36℃的环境下孵育18h后,用721分光光度计比浊。以叶酸浓度为横轴,光密度值为纵轴作曲线。试管1以及2的OD值要先减去相同浓度空白对照管的OD值,然后查这个试管的叶酸值,所以标本的VC血RCF(ng/mL)就是(试管1叶酸值×0.04+试管2叶酸值×0.02)/2。标本的红细胞叶酸值=[(VC血RCF×10)/红细胞压积]ng/mL。

2 结果

取高值以及低值的质控血清,进行20次的平行测定,可以得到高值血清的批内CV=3.5%,低值血清的批内CV=2.3%。连续测定20天,然后可以得到高值血清的批间CV=7.4%,低值血清的批间CV=5.2%。健康人员的测定结果表明红细胞叶酸的正常参考值为(585±70)ng/mL。

3 讨论

有两种方法可以测定叶酸,分别是微生物改良法以及竞争结合方法。后者的操作很简单,但是价格很昂贵,我国目前大部分用它来测定血清的叶酸。当肝功能以及肾功能受到损害的时候,叶酸是可以聚合的,这种聚合体用竞争结合的方法不能测定,但是微生物改良法可以测定,所以用微生物改良法能够满足测定肝功能以及肾功能受损患者的叶酸值。这种测定方法是很经典的方法,而且用保养液可以让菌株长期保存下去,如果保存过程当中菌株死亡,还可以购买新的材料重建该实验,不需要购买特殊的仪器,适用于大批量的测定。本实验的稳定性很好,适合在临床上推广使用。

[1]皇甫照,王毓明,郑家驹.96孔板微生物法微量测定血浆和红细胞内叶酸含量[J].卫生研究,2003(01):83-85.

[2]郝玲,郑俊池,田熠华,等.血浆叶酸两种常用检测方法检测结果的比较[J].北京大学学报:医学版,2004(02):45-46.

[3]杨波,冉家彦.应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究[J].长治医学院学报,2005(04):63-64.

[4]周林峰,贺爱军,周英.宜昌市2005—2007年出生缺陷监测结果分析[J].公共卫生与预防医学,2009(06):25-26.