MDM2和MDM4对P53调控研究进展

赵 婧 屈 艺 母得志

P53蛋白是DNA损伤的关键调节因子，对P53的严格调控是哺乳动物细胞存活所必须的，P53过多表达或不当的激活使细胞死亡，而表达减少或失活则导致肿瘤的发生。编码P53的基因在肿瘤中常发生突变或缺失，分别在1980年和1990年发现的鼠双微基因MDM2和MDM4在许多肿瘤中扩增和过表达，并可导致P53蛋白的失活［1］。通过与P53相互作用对其发挥调节作用的蛋白超过160种，几乎每月都会发现一种新的P53调节蛋白。而MDM2和MDM4不仅在肿瘤中表达经常发生变化，在胚胎发育过程中也对P53发挥特异性的抑制作用［2］。因此进行MDM2和MDM4对P53调控的研究，具有重要的病理生理意义。

一、MDM2和MDM4的蛋白结构

人类MDM2(HDM2)和MDM4(HDM4)分别含有491和490个氨基酸序列，蛋白结构相似，都含有三个进化保守的结构域:与P53 N端连接的N端结构域，一个锌指结构域(功能仍不明确)及C端的RING(really interesting new gene)结构域。还含有特异性的酸性序列结构域［3］。

X射线衍射晶体分析法明确了MDM2 N端与P53 N端主要通过疏水作用结合。P53疏水面的Phe19、Trp23和Leu26嵌入到 MDM2由13个氨基酸形成的疏水裂隙中，同时结合界面还有3处分子间的氢键相连以稳定这种结合［4］。MDM4有10个疏水氨基酸与MDM2相同，形成的疏水裂隙与MDM2相似［5］。在MDM2 N端含有的一段“lid”序列也参与P53－MDM2的相互作用，这段序列在MDM4中完全不同，说明MDM2和MDM4与P53的相互作用具有明显差异。最近研究还发现，MDM2与P53 N端结合后发生构象改变，有利于稳定MDM2的酸性序列结构域与P53的DNA结合域结合［6］。MDM4是否有此作用仍不清楚。

C端的RING结构域有利于MDM2和MDM4形成同源或异源二聚体［7］。MDM2的RING结构域对于其E3泛素蛋白连接酶活性十分重要，而MDM4没有泛素酶活性。多种翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、寡聚化及泛素化可影响MDM2和MDM4的功能和稳定性［8～10］。

二、MDM2和MDM4的生物学功能

在小鼠胚胎发育的研究中，敲除MDM2基因的胚胎在宫内因激活P53依赖的细胞凋亡通路发生死亡;敲除MDM4基因的胚胎则因依赖P53的细胞增殖抑制而发生死亡，但若同时敲除P53基因，胚胎能正常发育［2］。表明MDM2和MDM4可以通过不同的方式负调控抑癌蛋白P53。

1.MDM2——泛素蛋白连接酶:MDM2 是 RING型泛素蛋白连接酶的重要成员之一，大约10%的人类肿瘤存在MDM2的异常扩增或蛋白表达水平的增高而导致P53功能失活，MDM2是P53最重要的负调控分子之一。体外研究发现MDM2主要通过与P53直接结合抑制其转录因子活性及促进P53泛素化修饰和降解两种途径参与对P53的调节，同时MDM2基因也是P53介导的反式激活的靶基因，即形成MDM2 －P53 之间的负反馈调节环［11，12］。

2.MDM4——多功能蛋白:MDM4不是 P53的靶基因，也不具有泛素蛋白酶活性，主要是通过调节P53的活性发挥作用，与MDM2协同发挥其泛素蛋白酶活性［13］，也可通过依赖/不依赖MDM2增加和稳定P53蛋白表达水平，这两种完全相反的调节方式可能表明MDM4是一个多功能蛋白。缺失MDM4基因的小鼠较野生型小鼠的肿瘤发生率高。Mancini等［14，15］研究发现，位于线粒体内的 MDM4对 P53 发挥正性调节作用。降低MDM4蛋白水平使不同基因毒性(如UV、抗癌药物等)引发的P53凋亡作用减弱，并且是不依赖P53转录活性。线粒体MDM4约为胞质中的1/10，与Bcl－2结合，使Bcl－2锚定在线粒体外膜。在凋亡信号刺激下，线粒体MDM4稳定地定位于线粒体内，促进P53 Ser46磷酸化，并与Bcl－2结合形成复合物，促进细胞色素C的释放。但也有研究表明在分化成熟的神经元中，MDM4发挥抗凋亡作用。这可能与P53线粒体凋亡途径不是在所有细胞类型中存在有关［16］。目前也有学者认为在不同的细胞状态和损伤因素下，MDM4可能发挥不同的作用［17］。

3.P53－MDM2－MDM4调节网络:体外实验认为MDM2和MDM4在功能上相互联系，MDM4能稳定MDM2的表达，MDM2有利于 MDM4的核转位［18］。但体内实验研究则发现MDM2和MDM4对P53的调节具有不同的、互补的作用［19］。敲除小鼠P53基因中富含脯氨酸的结构域，其转录表达的P53△P蛋白对促细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用均较弱。这种突变小鼠能在敲除MDM4时存活，而在敲除MDM2时死亡。MDM4的缺失不影响MDM2的稳定性，而是增强P53△P的转录活性，能部分恢复其抑制细胞增殖的活性，但同时也使MDM2的表达增加，最终使P53△P的降解增加。反之，MDM2的缺失使P53△P表达增加，但每分子单位的活性并未改变。因此，MDM2可能主要调节P53的稳定性，MDM4调节P53的活性。同样的研究结果也在对中枢神经系统(central nervous system，CNS)发育的研究中观察到［20］。MDM2和MDM4在CNS早期就有表达，敲除二者之一，可使胎鼠发生无脑或颅脑畸形，如二者同时敲除，则发生更早和更严重的颅脑畸形，而这些改变均可在P53敲除的条件下恢复。

DNA受损后启动P53途径的前提是MDM2对自身和MDM4的降解。据此，Toledo等［21］提出了 P53损伤应答的动态模型。在正常细胞中，由于MDM2和MDM4的抑制作用，P53维持在较低水平;细胞受损后，MDM2对自身和MDM4的降解使P53的表达和活性开始增强;P53的激活也使MDM2表达增加，进一步降解MDM4，使P53充分激活;损伤因素消除后，累积的MDM2再次以P53为靶点发挥其泛素蛋白酶活性，MDM4表达也增加，P53活性下降。此模型中的几个关键点如正常状态下P53的降解及MDM2从自身降解到对P53降解的转换，仍需进一步研究。最近认为疱疹病毒属伴随的泛素特异性的蛋白酶(HAUSP)可能在其中发挥关键作用。正常的细胞中，死亡结构域相关蛋白(Daxx)、MDM2和HAUSP结合形成的复合物防止MDM2的自身降解，促使P53降解。而在细胞受损时复合物形成受阻，MDM2自身降解增加，P53 活性增强［22，23］。HAUSP 也能调节P53依赖的线粒体凋亡途径。因此，HAUSP和Daxx是P53－MDM2－MDM4调节网络的重要组成部分。

这个动态模型在包括成纤维细胞、神经细胞以及HCT116和U2OS细胞系中也得到证实，说明P53－MDM2－MDM4调节网络存在于许多组织中，可能在不同的细胞分化期中有所差异［24］。

三、MDM2和MDM4拮抗剂的研发

超过50%的人类肿瘤表达野生型P53和扩增的MDM2，由于P53信号通路的不正常调节，使其无法发挥正常的促凋亡和抑制细胞增殖的作用。因此，抑制P53与其负调控因子结合是一种很有应用前景的抗肿瘤策略。

如前所述，P53疏水界面的氨基酸是与MDM2相互作用的关键，因此，目前针对MDM2－P53相互作用的化合物可分为:①MDM2－P53相互作用的特异性阻断剂;②采用类似P53结合界面的低分子化合物竞争性抑制MDM2－P53的结合;③抑制MDM2泛素蛋白连接酶活性。其中顺式咪唑啉类似物Nutlin－3a在体外实验中显示出较强的干扰MDM2－P53相互作用，并明显抑制裸鼠骨肉瘤的生长且对正常细胞毒不良反应较小［25，26］。

线粒体MDM4在肿瘤治疗中可调节顺铂的反应性，高表达MDM4的人类卵巢肿瘤对顺铂治疗较低表达者疗效好［14］。在某些有野生型P53表达的肿瘤中如乳腺癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤中发现有MDM4基因扩增，但在某些肿瘤中又可见下调的MDM4。因此，针对MDM4研发的药物可能需要组织特异性。而且虽然P53－MDM2和P53－MDM4相互作用的结构相似，但抑制P53－MDM2的化合物对P53－MDM4的拮抗作用很弱。联合应用Nutlin 3a和siRNA MDM4的肿瘤细胞显示出更强的P53活性［27，28］。

P53－MDM2－MDM4与细胞生长、DNA损伤、肿瘤发生均有密切关系，对其相互作用及功能调控的深入研究将有利于理解不同细胞状态下促/抑凋亡的机制、诊治由凋亡系统功能紊乱而引起的各种疾病。

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