TRPA1介导哮喘和咳嗽机制的研究进展

杨建林 武 阳 丁书茂 陈如冲 杨 旭 赖克方

哮喘主要是由肥大细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞参与的慢性呼吸道炎症。特应性机体接触过敏原后诱导肥大细胞、嗜酸性粒细胞脱颗粒，释放前列腺素、组胺、白三烯、血小板活化因子等介质，引起气道平滑肌收缩，黏液分泌增加，血浆渗出和黏膜水肿，引发急性与慢性支气管哮喘［1］。使用TRPA1的阻断剂，能明显降低气道高反应性，减轻哮喘与咳嗽的症状。肥大细胞释放因子激活T细胞和B细胞，辅助性T细胞释放细胞因子，Th1型细胞产生干扰素γ、IL－2、TNF－β等，Th2型细胞产生IL－4、IL－ 5、IL －6、IL －10、IL－13 等，这两种 Th1和Th2产生一些共同的细胞因子 IL－1、IL－3、IL－8、TNF－ α、GM－CSF 等［1］。在 TRPA1缺失和 HC －030031阻断情况下嗜酸性粒细胞、IL－5、嗜酸细胞趋化因子、TNF－α、IL－13、RANTES、MCP－1释放减少［2］。因此，哮喘与咳嗽的诱发是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与的恶性循环，刺激物通过激活TRPA1受体，引发一系列的反应，诱发呼吸道疾病。

一、TRPA1膜蛋白的研究进展

TRPA1，又称 ANKTMI蛋白，归属于 TRP家族。2003年由Story等在小鼠DRG、三叉神经节中首次发现，而且97%的TRPA1与TRPV1是共表达的，温度低于17℃能被激活，是一种冷痛觉感受器［3］。ANKTMI蛋白主要在初级感觉神经元表达，外周神经系统中主要存在于成纤维细胞和角化细胞，肺组织ANKTM1跨膜蛋白也表达在成纤维细胞［4］。Stokes等研究显示，TRPA1在心脏肌细胞、胃肠黏膜、脑、肾上皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、前列腺上皮细胞、皮肤等组织上表达，而且在T淋巴细胞、B淋巴细胞、人类乳腺细胞、肺成纤维细胞、PC12、HT22、IMR90、大鼠嗜铬瘤细胞上表达［5］。最近的研究显示，在内耳纤毛细胞中也有表达，并参与听觉传导［7］。在人的ANKTM1跨膜蛋白由1119个氨基酸组成，老鼠的ANKTM1蛋白由1125个氨基酸组成，其人的染色体定位为8q13，人的 ANKTM1跨膜蛋白相对分子质量是127.379kDa［4］。ANKTM1跨膜蛋白有6个跨膜区结构域和1个孔道组成，其中S6区是激活剂与拮抗剂结合必须的位点，N末端包含有14个与锚蛋白结合的部位，N末端有1个EF手性钙结合域，能够增加细胞内钙离子［8］。温度、机械力、环境刺激物激活TRPA1产生疼痛、机械损伤、神经炎症［7］。TRPA1可被辣根、肉桂醛、大麻、蒜素、芥末、质子等众多外源性有机小分子激活，但是对薄荷醇无反应［9］。最近研究显示，TRPA1通道能被多种环境化学刺激物激活，这些刺激物包括异氰酸酯、丙烯醛、甲醛、氯气等［10］。运用钙离子及荧光成像技术对大量化学物激发TRPA1通道能力进行测试，发现内源性化合物4－HNE、ROS、RNS 能激活 TRPA1 通道［11］。一些化合物也能通过激活细胞其他受体，激活PLC与PKA两条信号通路激活TRPA1通道，如缓激肽、NGF等，最近的研究推断TRPA1与配体之间是共价键的相互作用，而不是传统的受体与配体的相互作用，如甲醛、乙醛、4 －ONE、4 －HNE、15d －PGJ2、PGA2、8 － 异 －PGA2等，这些化合物可能发生巯基反应激活TRPA1［12］。

二、TRPA1与哮喘的研究进展

支气管哮喘是一种常见呼吸系统疾病，是有多因素诱发的疾病。多年来哮喘的发病率呈上升趋势，已经成为呼吸道最为严重的疾病之一。目前研究显示，当机体受到外界刺激时，将释放包括CGRP、SP、神经激肽A。反过来，这些物质能会导致支气管收缩，激活肥大细胞，释放炎性因子，诱发哮喘。刺激诱发哮喘的多数化合物能激活 TRPA1，如甲醛、氯气等［9］。而且TRPA1的激动剂，能使炎性因子上调，这和哮喘的发生相通。通过基因敲除TRPA1小鼠哮喘模型研究，其炎症因子减少和气道高反应性明显减轻，在TRPA1缺失和HC－030031阻断情况下嗜酸性粒细胞、IL－5、嗜酸细胞趋化因子、TNF －α、IL －13、RANTES、MCP－1释放减少［2］。目前的抗哮喘的药物尚不能完全治愈。因此，弄清楚发病机制，开发新型、可靠的药物具有很高的价值。

1.TRPA1与呼吸道:呼吸道中，ANKTM1跨膜蛋白主要表达在背根神经节的迷走神经和感觉神经纤维上;在呼吸道非神经细胞中，在肺组织中的成纤维细胞中也有表达，TRPA1与TRPV1共表达在呼吸道初级感觉神经元上，控制P物质、NKA、CGRP的释放［4，13］，这些物质刺激肥大细胞，影响 T淋巴细胞和B淋巴细胞产生炎性因子，诱发神经炎症，进而诱发哮喘。环境污染物激活TRPA1能诱发多种呼吸道疾病，包括职业哮喘、RADS、咳嗽等，TRPA1选择性激动剂肉桂醛激活受体，从支气管感觉神经元产生C－纤维动作电位，引起迷走感觉神经咳嗽反射［14］。

2.TRPA1与内源性因子

(1)活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、次氯酸(ClO－):哮喘的发生就是一个氧化应激的过程，当呼吸道氧化剂和抗氧化剂失衡就能诱发哮喘［15］。炎性细胞浸润的肺泡腔，释放活性氧、活性氮、过氧化氢、次氯酸等，活性氧引起的TRPA1启动，可能是活性氧促进邻巯基形成二硫键来影响TRPA1，RNS是NO的供体，NO具有润滑支气管和抑制产生炎性细胞信号蛋白的作用，哮喘病人有高NO合成，ROS通过与NO结合产生高活性氮RNS，并造成硝化应激诱发哮喘，RNS通过氧化半N－末端半胱氨酸残基，能直接激活TRPA1［15，16］。H2O2能够直接激活 TRPA1 受体，Fe2+催化H2O2产生的自由基，激活 TRPA1［16］。次氯酸钠大量存在于发炎组织中，实验证明能够在体外和体内激活TRPA1。

(2)前列腺素(prostaglandin，PGs):前列腺素是花生四烯酸被环加氧酶水解的产物，为二十碳不饱和脂肪酸。体内分布广泛，已发现10余种，其功能各异。PGE和PGD支气管有明显的舒张作用，能刺激咽喉，引起咳嗽。PGD2是肥大细胞被活化抗原应答花生四烯酸代谢产物，人类哮喘发作过程中PGD2被大量释放，在哮喘过程中，它已作为肥大细胞活化标志，PGD2可抑制血小板凝聚、血管扩张、支气管平滑肌收缩，肥大细胞释放的PGD2可以作为过敏反应和炎症反应的调节分子［17］。目前的研究发现，通过G－蛋白偶联信号刺激DRG，引发炎性疼痛，主要是激动剂与质膜上的特异受体结合，激活PLC，PIP2水解产生IP3及DAG，再由DAG激活PKC，IP3增加细胞内钙离子浓度［18］，钙离子浓度上升激活TRPA1。环戊前列素又名 PGA2、PGA1、PGJ，经过进一步代谢产生12－PGJ2和15－ d－PGJ2。在与 TRPA1体内实验表明，环戊前列素通过TRP通道途径调节神经元，15d－PGJ2通过激活 TRPA1，引发疼痛动作反应［19］;环戊前列素能够诱发钙离子大量涌入表达TRPA1的CHO细胞和背根神经节神经元;使用阻断剂后疼痛消弱，钙离子内流减少［20］。总之，前列腺素参与哮喘的发生，其中可能是通过激活TRPA1引起。

(3)内生醛(R－CHO):人类机体自身也能产生醛，不同的细胞、不同的组织含量不同。脂质过氧化生成醛含量最丰富的是丙二醛、4－HNE、丙烯醛、己醛［21］。4－HNE在肺组织由花生四烯酸、亚油酸及其衍生物分解产生的α，β－不饱和醛，体内能到达很高浓度，慢性阻塞性肺病人与吸烟者肺部，测定4－HNE的水平明显要高，已被证明4－HNE、丙烯醛能激活TRPA1，在呼吸道产生神经性疼痛和炎症，丙烯醛和4－HNE激活TRPA1的机制，涉及TRPA1的N－端的结构域赖氨酸残基共价修饰［11］。内源性甲醛主要是由脂质过氧化产生，细胞核内的甲醛主要是DNA甲基化和脱甲基化产生。体内甲醛含量的异常升高，可以造成严重的呼吸道疾病［22］。内源性饱和醛，如甲醛和乙醛，都能激活小鼠神经元和重组表达的 TRPA1，并引起的疼痛［23］。

(4)神经生长因子(nerve growth factor，NGF):神经生长因子是神经细胞分化、生长、发育必需的神经营养因子，能调节多种免疫细胞，促进炎性细胞释放，导致气道炎症、气道高反应性、支气管重塑［24］。严重哮喘患者的血清、肺泡灌洗液、支气管黏膜中神经生长因子呈上升趋势。NGF可由多种神经细胞与免疫细胞分泌，如神经元与巨噬细胞。NGF通过诱导神经源性炎症参与诱发哮喘，涉及到TrkA的受体、TRPV1、TRPA1的激活促进咳嗽及呼吸道阻塞，NGF与Trk A的免疫球蛋白IgG C2区域结合导致Trk A的酪氨酸残基自身磷酸化，活化PLC与PKC通路，激活TRPV1与TRPA1，在背根神经节中，NGF能够通过激活p38MAPK通路增加TRPA1的表达，而抗神经生长因子或p38 MAPK抑制剂降低了TRPA1表达，并且抑制炎症和冷痛觉过敏引起的神经损伤［25，26］。

(5)缓激肽(bradykinin，BK):缓激肽是重要的炎性因子，参与痛觉过敏和炎症反应。在哮喘和鼻炎患者，肺泡灌洗液和血清中的缓激肽呈上升趋势［27］。缓激肽能够使HEK293细胞中表达的TRPA1和β2电化学势差发生改变，这个势差可以被PLC和PKA的抑制剂和激活剂调节，缓激肽能通过其β2受体和PLC而激活表达于CHO细胞中的TRPA1通道，而在背根神经元中，缓激肽可通过其β2受体激活PLC与PKA两条信号激活TRPA1通道的作用，缓激肽注射基因敲除TRPA1小鼠未能引起机械或痛觉过敏，从而表明TRPA1是缓激肽作用必要的［28］。

(6)Ca2+与低气温:Ca2+是机体广泛存在的离子，TRPA1对细胞内产生的Ca2+比较敏感［7］。最近研究显示，Ca2+直接结合到TRPA1的N－端EF手性Ca2+结合域，导致通道激活［7］。G蛋白偶联受体介导的各种PLC的信号通路，膜磷脂水解活性的PLC(PIP)生成DAG和三磷酸肌醇(IP3)的，这反过来引起从ER Ca2+的释放，可能导致 TRPA1激活［8］，脂质代谢的PLC，如甘油二酯的，也有助于TRPA1激活。冷激活TRPA1是目前研究有较多争议，Ca2+参与激活寒冷的敏感性通道，细胞内钙离子浓度在未转染TRPA1的HEK293细胞升高［7］。然而，从最近的研究结果，低气温启动不需要细胞内Ca2。

3.TRPA1与环境污染物

(1)香烟烟雾:香烟烟雾中含有数百种复杂的化学成分，大部分对人体有害。吸烟能引起多种呼吸道疾病。暴露在香烟烟雾中的人，诱发哮喘的概率呈上升趋势。香烟烟雾能引起急性哮喘，加快哮喘的发作和肺功能下降。香烟烟雾诱发的哮喘体内与体外研究表明，具有较高中性粒细胞浸润。在啮齿类动物，吸入的香烟烟雾造成神经性血浆蛋白外泄，是由于辣椒素敏感的感觉神经元释放神经肽P物质和神经激肽引起，然而，香烟烟雾引起的血浆蛋白外渗的不是通过TRPV1受体介导的，因为TRPV1选择性拮抗剂CZP不能抑制外渗，最近的研究发现，香烟烟雾提取物CSE、不饱和巴豆醛、丙烯醛，都能激活TRPA1受体。因此可以得出结论，香烟烟雾引起气道神经性炎症，是通过TRPA1刺激介导的，不饱和醛是香烟烟雾中的主要诱导物质。

(2)其他空气污染物:空气污染是现代城市生态环境严重的问题，工业生产与人类生活排放大量空气污染物，直接影响人类的正常生活。而其中一些化合物极易挥发、光解，经过一系列反应，产生NO、O3、醛等混合物，引起呼吸道疾病。例如油漆、农药等光解释放的醛类可以导致哮喘。氯气、甲醛［10］、异氰酸酯等化合物是被广泛使用的化合物，人体吸入可导致多种呼吸道疾病和组织损伤，例如咳嗽、鼻炎、咽喉发炎、呼吸困难、胸闷等。其中丙烯醛、NO、甲醛等都直接或间接激活TRPA1。最近研究表明，次氯酸盐类激活在HEK293细胞中表达TRPA1通道，次氯酸钠引发TRPA1敲除的小鼠呼吸不良反应明显降低。甲醛能诱发哮喘，甲醛可能通过促进P物质的释放而调控多种肥大细胞功能，低浓度甲醛单独作用可导致低水平的组胺释放，甲醛致痛反应是由TRPA1通道所介导的，通过钙离子成像技术发现甲醛能够引起背根神经元中TRPA1通道的开放，使用TRPA1通道的特异性阻断剂或TRPA1基因敲除后，均能显著抑制甲醛所引起动物的双相痛觉过程［10］。甲苯二异氰酸酯是低分子、易挥发的化学物质，工业上被广泛使用，对呼吸道的刺激严重，可引起哮喘性气管炎和支气管哮喘，是引起职业性哮喘的重要化合物，最近研究显示，TRPA1可以调节甲苯二异氰酸酯引起的呼吸疾病，它能激活呼吸道感觉神经元上的TRPA1诱发呼吸道反应，但对基因敲除小鼠无反应。因此推测，空气污染物诱发哮喘可能是直接或间接通过激活TRPA1引起。

三、TRPA1和咳嗽

感觉神经纤维密集的分布于上皮细胞层从鼻到下呼吸道，感应呼吸系统的刺激性和潜在有害物质，将启动一系列反应，旨在保护肺免受伤害。咳嗽代表肺保护的最强大的机制之一。打喷嚏、咳嗽、黏液分泌是呼吸系统接受外界刺激清除有害物质的一种自身保护反射。在哮喘发病早期阶段，大约有5%～6%是以持续性咳嗽为主要症状的，咳嗽变异性哮喘是常见的，是多种激素参与的气道反应［14］。研究显示，TRPA1与TRPV1是咳嗽反射主要的灵敏元件，而TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8 还没有足够的证据参与咳嗽反应，豚鼠吸入TRPA1兴奋剂肉桂、异硫氰酸酯等，引起强烈的咳嗽反应，镇咳药物樟脑和庆大霉素可以抑制TRPA1，而起到镇咳作用，HC－030031可以完全阻断咳嗽，TRPV1受体拮抗剂CZP却不能完全阻断咳嗽。吸入香烟烟雾的豚鼠咳嗽能被钌红、樟脑、HC－030031抑制，根据结论推断，吸烟引起的咳嗽可能是由烟雾中的自由基、丙烯醛、巴豆醛等激活TRPA1引发。TRPA1将发展为新型镇咳药物的靶点。

四、小 结

随着研究的不断深入，哮喘与咳嗽的发病机制将越来越清晰。从目前的研究来看，TRPA1在哮喘和咳嗽的发生中扮演一个重要的作用。诱导哮喘与咳嗽的化合物，无论是细胞内源因子，还是外源因子，都能激活TRPA1。激活TRPA1，究竟是配体与受体结合，还是化学键之间的相互作用，还存在很多争议。TRPA1的拮抗剂能够减轻哮喘症状，能阻断气道高反应性。庆大霉素、钌红、阿米洛利TRPA拮抗剂显示在对体外表达TRPA1有效，但体内效果不是很好。TRPA1选择性拮抗剂HC－030031，实验动物模型中抑制缓激肽诱导的机械痛、甲醛缩腿反应、OVA致敏小鼠水肿。鉴于TRPA1几个病理生理条件作用，可以预见在不久的将来，新型拮抗剂数量将大幅增加。

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