衰老机制的分子水平研究进展

王博雯(综述)，李应东，姚 凝(审校)

(甘肃中医学院，兰州730000)

衰老(senescense)又称老化，是指生物体在其生命的后期所进行的全身性、多方面、循序渐进的退化过程，这种退化过程在整体水平、组织细胞水平及分子水平各个层次均有体现［1，2］。人类对衰老机制的研究始于整体水平和器官水平，主要表现为机体形态结构和功能方面出现的一系列退行性改变，细胞凋亡或坏死导致细胞数量减少，脏器萎缩，组织弹性减低等，从而进一步引起多种器官生理功能的逐步减退。随着生命科学的飞速进展，衰老机制的细胞水平、分子水平的研究越来越深入，并且被认为是揭开衰老本质，防治老年病的重要环节［3］。人们也已经从多个物种找到了与衰老有关的基因，探讨了衰老期间基因及其调控变化的特点，进一步研究了衰老与老年性疾病发生、发展的相关性［4］。深入研究和阐释衰老机制的分子水平研究，对改善和预防老年性疾病的发生十分重要。

1 端粒与细胞衰老

端粒是存在于真核生物染色体末端的一种特殊结构，由进化上高度保守的DNA重复序列TTAGGG及相关蛋白质组成，它如同帽子一样罩在染色体长臂上，包裹着染色体的头部，防止染色体末端被酶解或两条染色体的端区融合、丢失或重排，以维持染色体的稳定性和完整性。

1973年，前苏联科学家Olovnikov提出人体细胞不能改变其DNA复制时染色体两端的缩短，指出细胞在每次分裂过程中都会由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体，导致复制的DNA序列有所丢失，最终造成细胞衰老死亡，推断端粒丢失的原因很可能与端粒相关基因的致死性缺失有关，创造性地提出端粒的长度决定着细胞的寿命，被后人称为衰老的“端粒学说”或“细胞有限分裂学说”［5］。

1992年，Harley等［6］发现体细胞的染色体端粒DNA会随细胞分裂次数增加而不断缩短，体细胞每传代一次，端粒就缩短50～200 bp。与端粒长度和细胞衰老有关的最有力的试验证据来自于人类的成纤维细胞，年轻人成纤维细胞内端粒的平均长度为18～25 kb，而老年人成纤维细胞内端粒的平均长度为8～10 kb，估计细胞每分裂一次，端粒缩短50～100 bp［7］。张宗玉等［8］研究发现人胚肺二倍体成纤维细胞每增加一代龄，端粒长度减少约49 bp，同时还测定了人体外周血白细胞端区长度随增龄变化，发现其长度平均每年减少约35 bp。随着每一次的细胞分裂，染色体都会丢失一部分端粒序列，当其缩短到一个临界长度，即末端限制性片段的长度时，细胞不再分裂，逐渐衰老直至死亡。因此，端粒又被称为决定细胞衰老的“生物钟”［9］。

2 端粒酶与细胞衰老

端粒酶又称端粒末端转移酶，是一种反转录酶，由RNA成分、催化亚单位和端粒酶相关蛋白1三个亚单位组成。近期研究表明，催化亚单位是端粒酶活性所必需的，是RNA依赖的DNA聚合酶，其自身携带模板。端粒酶的主要功能有:①通过自身的RNA模板，催化亚单位和辅助蛋白将端粒DNA添加到染色体末端。②维持和平衡端粒序列长度。③修复断裂的染色体末端。断裂的染色体末端即使没有完整的端粒重复序列存在，但富含G、T的DNA存在，也能被端粒酶作为引物DNA而复制，以维持基因组遗传的稳定性［10］。

Harley等［11］提出了较为完备的端粒-端粒酶假说，认为正常细胞的端粒缩短到一定程度时会启动终止细胞分裂的信号，使细胞进入第一死亡期M1并退出细胞周期而老化;如果细胞被病毒转染或某些抑癌基因发生突变，细胞可越过M1期而继续分裂并进入第二死亡期M2，这时大部分细胞由于端粒太短而失去功能以致死亡。而极少数的细胞在此时激活了端粒酶，从而使端粒不再缩短，获得无限增殖能力而成为永生化细胞。在正常体细胞中，端粒酶的活性很难测知，随着细胞的分裂，端粒长度不断缩短，从而使细胞老化。相反，在有端粒酶活性的细胞(如生殖细胞、肿瘤细胞和肝细胞)中由于端粒不断得到补充延伸，因而细胞会表现出不死性［12］。

3 DNA修复能力与细胞衰老

有人认为DNA分子损伤的累积和修复能力的减退与衰老密切相关［13］。1999年，美国麻省理工学院Johnson等［14］把DNA损伤列为引起生物衰老的重要因素，且有人将此作为衰老的生物学年龄标志之一。人类细胞中的DNA在内环境(如自由基)和外环境(如阳光中的紫外线、化学物质)等有害因素作用下，DNA链受损而发生断裂，以一条链断裂最为多见。DNA链断裂后则使遗传信息不能准确地传至下一代，但细胞具有一整套修复DNA链断裂的酶系，从而得以保证遗传信息由亲代高保真地传至下代。但DNA的这种修复能力随增龄而减退，致基因表达异常，错误遗传信息不断累积，细胞功能逐渐减退，最终导致细胞衰老直至死亡。Waldstein等［15］利用紫外线诱发人外周血淋巴细胞DNA修复过程，发现年轻人供体细胞的DNA修复能力高于中、老年人供体细胞。Nette等［16］测定了人上皮角化细胞的DNA修复能力，发现其修复能力随细胞供体年龄的增长而降低。韩宗超等［17］对大鼠衰老神经细胞DNA氧化损伤与修复进行研究，结果发现，无论是衰老细胞还是正常细胞，当DNA受损时，都具备一定的自我修复能力，但衰老神经元的DNA易损性增加，修复性能较差。这些研究均提示细胞DNA抗损伤能力下降与衰老过程存在因果关系。

4 衰老基因与细胞衰老

在人类细胞方面，衰老相关基因的研究，近年来有较大进展。20世纪90年代以来，纷纷报道人1、4、6、7、11、18号染色体与X染色体上各自存在着与衰老相关的基因。Smith等［18］领导的研究组利用细胞与细胞融合技术研究表明，至少有四套基因或基因通路与衰老有关。该研究组的Bryce等［19］发现了位于第4号染色体的一种称为MORF4(mortality factor from chromosome 4)的基因与衰老密切相关。该基因在衰老和生长静止细胞中高表达，它的突变可引起细胞永生化。此外，Sugawara等［20］与Klein等［21］曾分别报道人的第1号染色体长臂与X染色体有促进细胞衰老的基因，从人二倍体成纤维细胞筛选出了一种衰老协同基因，其在衰老细胞中的表达比年轻细胞高3倍，而且它的增高程度与细胞生长能力的降低密切相关。

5 长寿基因与细胞衰老

机体内存在一些与长寿或抗衰老有关的基因，目前已确定的与衰老或长寿有关的基因有10多种［4］，它们分别是 age-1、ras2p、lag-1、lac-1、daf-2、daf-16、daf-23、clk-1、spe-26、gro-1等。生物遗传学家新近发现了两类长寿基因:一类称为蛋白质生物延长因子基因;一类称为抗氧化酶类基因。这两类基因可使生物体内代谢呈正氮平衡并保护人体组织免受自由基的损伤，延长人类寿命。Klotho基因是由Kuro-o等［22］在1997年研究自发性高血压时发现的与抗衰老有关的基因。Klotho基因突变的小鼠会过早出现与人类衰老相似的症状，且寿命缩短，而其过度表达会使小鼠的寿命延长［23］。该基因主要表达于肾脏和脑组织，同时具有配体、受体和酶的功能，有调节钙磷代谢、抗衰老、抗氧化、抗凋亡的作用，并以此实现对脏器的保护［24，25］。

6 p16基因与细胞衰老

pl6基因是近年来发现与衰老有关的调节基因，位于人类染色体9p21，在衰老的成纤维细胞、T淋巴细胞、角质细胞、上皮细胞、内皮细胞等细胞中表达增强。因其存在一个基因序列为GAAGGT的负调控元件，而年轻细胞中所含的相对分子质量为24×103的蛋白质因子可与此负调控元件结合，抑制p16基因表达(衰老细胞中缺乏此因子)，故 p16高表达［26］。有研究表明［27，28］，p16基因水平的升高是衰老即端粒持续性缩短的诱因，而非衰老的结果。抑制p16的表达DNA修复能力增强，端粒缩短速度延缓，细胞衰老程度减轻，寿命延长。p16基因不仅可影响细胞寿命和端粒(细胞的生物钟)长度，还被看作是人类细胞衰老遗传控制程序中的主要环节之一。它促进衰老的分子机制是通过调节RB蛋白的活性，而非激活端粒酶起作用。RB蛋白是细胞周期G1/S期的调控因子，能与转录因子e2F(转录因子的一种)结合，阻断DNA复制，抑制多种生命必需基因表达。p16基因所编码的p16蛋白能够抑制细胞周期依赖性激酶CDK4(为细胞周期依赖性激酶的一种)的活性，使靶蛋白不能被磷酸化，未被磷酸化或低磷酸化的RB蛋白与e2F结合，抑制其活力而引起细胞周期停滞［29，30］。

7 线粒体DNA损伤与细胞衰老

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺失突变与衰老关系的研究也是国内外研究衰老机制的热点之一。mtDNA是细胞核外遗传物质，为双链闭合环状结构，由16 569 bp组成［31］。mtDNA约占细胞总DNA的0.5%，不含内含子，约10%的线粒体蛋白质由其编码，包括呼吸链中一些重要酶的亚基。在线粒体氧化磷酸化生成人ATP过程中，有1%～4%摄入的氧转化为氧自由基，故线粒体是氧自由基产生的主要场所。线粒体DNA是裸露的，缺乏组蛋白和DNA结合蛋白的保护，易受氧自由基损伤，且损伤后因缺乏修复系统而不易被修复。因此，mtDNA突变率高，是核内DNA的10～100倍［32］。mtDNA损伤后可引起呼吸链有关蛋白质亚单位的合成障碍，形成有缺陷的呼吸链，呼吸链功能因此而受损，导致机体细胞ATP合成水平降低，提供给细胞的能量不足，从而出现一系列衰老表现，尤其是心、脑等以ATP为主要能源的代谢旺盛器官表现尤甚［33］。呼吸链功能下降，进一步引起自由基堆积，加重mtDNA损伤。随增龄等因素，mtDNA突变累积，形成恶性循环，从而加速细胞衰老。

研究表明［34］，与衰老有关的mtDNA的突变有5种:①大片缺失;②点突变;③插入;④D-loop区小的串联重复;⑤DNA重排。报道较多的是点突变和片段缺失。Michikawa等［35］研究发现，老年人成纤维细胞线粒体基因组DNA复制区点突变率较年轻人高。Cooper等［36］发现，人体骨骼肌mtDNA 5.0 kb片段丢失率21岁时仅为10－5，78岁时升至2×10－4;正常老年人心血管组织中还存在7.4 kb片段丢失，丢失频率亦随增龄而增加。Cortopassi等［37］发现成人心脏、肌肉和脑的mtDNA都存在一些片段缺失，但胎脑和胎心则无此现象，无论是点突变还是片段缺失，其频率均随增龄而增加。mtDNA片段丢失还与某些老年病有关，如2型糖尿病、帕金森病和阿尔茨海默病等［38］。

8 结语

细胞衰老机制复杂，导致衰老的因素也是多方面的，不存在走向衰老的统一通路，各种加速衰老的因素通过各自的途径，导致细胞和机体某一功能的塌陷，继而引起细胞和机体功能全面的塌陷，这可能是衰老的普遍机制［39］。无论是从整体水平，还是细胞与分子水平，各种学说相互之间并非对立，它们互为因果、相互补充或同时作用，但都有其局限性。可以预料，深入探讨衰老机制的新途径对老年性疾病的研究具有重要的推动作用，对老年性疾病发生、发展的认识及有效防治具有划时代的意义，必将为推迟老年带病期的到来提供新的机遇。

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