小鼠子宫内膜干细胞的研究进展

王燕华(综述)，曲军英(审校)

(福建医科大学附属第一医院妇产科，福州350004)

干细胞是一类具有高度增殖、自我更新和分化潜能的细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞为囊胚的内细胞团，具有高度自我更新和全能性，能够分化为三个胚层的各种细胞［1］。成体干细胞是一类位于很多组织器官中的一小群细胞，也称为祖细胞，其可通过不对称分裂进行自我更新和产生不同谱系的子细胞［2］。由于人子宫内膜干细胞在现实研究中受到限制，小鼠子宫内膜干细胞研究可能成为一个重要的研究模型。

1 小鼠子宫内膜干细胞鉴别与定位技术

在干细胞鉴别与定位常用的技术中最常用的是标记滞留细胞技术。标记滞留细胞技术是利用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)标记细胞，在DNA复制过程中摄取BrdU为合成原料而标记细胞，利用DNA半保留复制的特点，在注入BrdU后的追踪过程中快速增殖的细胞将稀释甚至丢失标记，由于干细胞有慢细胞周期和半保留复制等特点，细胞内将仍保留有BrdU标记，通过用特异性的抗BrdU抗体，检测到的BrdU滞留细胞有可能是成体干细胞［3］。由于BrdU标记后对子宫内膜干细胞定位和定量是通过免疫组织化学技术反应进行的，因此其不适用活体子宫内膜干细胞研究，且其定量受到免疫组化过程中各种因素的影响，不能准确地反映实际子宫内膜干细胞的量。

Hoechst 33342-SP法是近年来广泛用于筛选成体干细胞的一种方法。Hoechst 33342是一种能与 DNA特异性结合的荧光染料，癌细胞［4］和 干 细 胞［5］可 以 将Hoeehest 33342排出细胞，表现为细胞核不着色或者低程度着色，利用流式细胞仪可以将这些不着色细胞加以分离，人们将这种可以排除Hoechest 33342的特性称为SP表型，将利用该特性分离的这部分细胞称为SP细胞［6］，Hoechst 33342-SP法可用于研究小鼠子宫内膜干细胞［7］，也可用于研究人子宫内膜干细胞［8］，但都只适用于体外研究，不适用于干细胞体内细胞定位。

2 小鼠子宫内膜干细胞在子宫内膜的定位

子宫内膜干细胞常处于静止期(G0期)，位于保护的微环境中，这种环境称为“壁龛”［9］。随着细胞的分裂分化，子宫内膜干细胞在子宫内膜的位置将发生变化。Cervelló等［10］研究发现，出生3 d的小鼠注射BrdU后追踪，注射后7 d，所有上皮和间质细胞均表达BrdU，随后在小鼠青春期前(21～49 d)BrdU阳性细胞剧减，21 d时，所有上皮细胞均丢失BrdU，表达BrdU的间质细胞数量剧减，到成年(49 d)后，只有少量位于内膜基层连接处，血管周围旁边的间质细胞表达BrdU。

有学者研究发现，产后小鼠子宫内膜具有更多的干/祖细胞(SP细胞)，其用Hoechst 33342-SP法在产后第1、3、7、14、17．5、21、28 天的小鼠内膜中均可测得SP细胞群，其含量随产后时间的延长呈现先升高后降低的趋势，在产后17．5 d子宫内膜中SP细胞群达到最大含量，随后逐渐下降，在产后60 d几乎无法测得，原因可能为分娩过程中子宫内膜受损所致［6，11］。因此，认为产后是子宫内膜干细胞生理性募集的时间点，在这一时期，某些信号转导启动细胞募集、增殖、分化，重建完整的组织;但在研究中并未对这些干/祖细胞在子宫内膜中的定位进行分析。

3 子宫内膜干细胞表面标志

目前尚未发现子宫内膜干细胞表达特异性标记。与人子宫内膜干细胞一样，小鼠子宫内膜干细胞也表达未分化的干细胞标志。Szotek等［2］研究发现，小鼠子宫内膜干细胞表达干细胞标志(干细胞抗原1、sca-1)、内皮标志CD31、成纤维细胞标志平滑肌激动因子α、雌激素受体α，不表达造血细胞标志CD45。Cervelló等［10］研究发现，小鼠子宫内膜细胞表达未分化标志c-Kit和POU5F1(一种核转录因子)。而Chan等［12］研究发现，小鼠子宫内膜干细胞表达干细胞抗原 1、CD31、CD45、Ki-67(增殖标志)、雌激素受体α、平滑肌激动因子α，不表达c-Kit。总之，子宫内膜干细胞表面标志目前尚无统一定论，众多学者仍致力于此方面的研究。

4 子宫内膜干细胞的分离与培养

胡菲菲等［6］从生育期小鼠四个动情期(动情前期、动情期、动情后期、动情间期)和产后小鼠子宫内膜分离干细胞，并比较从这些小鼠子宫内膜中分离出的子宫内膜干细胞的量，首先用酶法获得子宫内膜细胞，再用Hoechst 33342染色，维拉帕米阻止细胞内Hoechst 33342排出，再用流式细胞仪荧光活化分选系统将被染色细胞分选出来培养，结果从未孕小鼠四个动情期均未分离出干细胞，而能从产后小鼠子宫内膜中分离出干细胞，其原因为正常动情期鼠子宫内膜干细胞较少，Hoechst 33342-SP法不能灵敏地将其分离出来。分离获得的子宫内膜干细胞采用有限稀释法培养，培养液成分为dulbecco modified eagle medium(DMEM)/Ham's，10% 胎牛血清，1%青/链霉素，培养15 d后见细胞克隆，并认为添加上皮生长因子和17β雌二醇对小鼠子宫内膜干细胞体外培养并不能增加其克隆形成率，且雌激素在体外有促进腺体克隆细胞分化的作用。有研究发现上皮生长因子在一定浓度范围内可促进子宫内膜上皮细胞生长［13］。Komatsu 等［14］研究发现，上皮生长因子和转录生长因子α可刺激子宫内膜间质细胞生长，但对这种促进作用产生的信号转导通路并未阐明。小鼠子宫内膜干细胞体外培养目前是比较新的研究领域，对于内膜干细胞分离培养技术、细胞因子添加的种类和量及其作用机制目前尚无统一的研究结果。

5 小鼠子宫内膜干细胞体外培养分化

Meng等［15］研究发现，从人的月经血中收集子宫内膜干细胞在体外培养，用完全DMEM培养基培养过夜贴壁后，更换成成骨细胞、内皮细胞、神经细胞诱导培养基培养21 d可诱导分化为成骨细胞、内皮细胞和神经细胞;换成肝细胞和胰腺细胞诱导培养基，并添加肝细胞生长因子、纤维母细胞等细胞因子培养30 d，可诱导成肝细胞和胰腺细胞;培养过夜贴壁后，用含有5-氮杂胞苷的DMEM处理24 h后，用添加有骨骼肌生成因子、纤维母细胞生长因子等细胞因子的DMEM培养40 d，可诱导分化为心肌细胞和骨骼肌细胞;用完全DMEM培养基培养到细胞至100%汇合时，更换成脂肪细胞、肺上皮细胞诱导培养基培养10 d后可诱导成脂肪细胞和肺上皮细胞。Dimitrov等［16］从子宫内膜基底层分离子宫内膜干细胞体外培养可形成克隆，将这些细胞培养与脂肪细胞诱导培养基后可诱导分化为脂肪细胞。而在小鼠子宫内膜干细胞培养方面，目前尚未有体外诱导分化的报道。

6 结语

子宫和子宫内膜是维持女性生理功能和生育能力的重要器官，子宫内膜具有强大的增殖能力。然而，子宫内膜极易受流产、感染和内分泌影响，而导致增生能力下降，从而严重影响女性的生育能力。同样，子宫内膜增殖能力过度也会导致诸如子宫内膜异位症、功能性子宫出血、子宫内膜增生过长、子宫内膜癌等诸多疾病，严重影响女性健康和生活质量。子宫内膜干细胞研究对于诸如此类的女性生殖健康疾病有着重要意义，可从根本上解决这些问题。人子宫内膜干细胞研究受到很多方面的限制，因此，小鼠模型起着重要的作用。目前，小鼠子宫内膜干细胞研究尚处于初级阶段，还有许多尚未解决的问题，因此小鼠子宫内膜干细胞研究具有广阔的前景。

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