Smads与器官纤维化关系的研究进展

杨 絮（综述），张勇刚（审校）

（汕头大学医学院第一附属医院心内科，广东汕头 515041）

器官纤维化是指某器官由于局部缺血、化学物理因素、免疫反应、感染等慢性损伤，导致细胞外基质合成与降解失调、基质过量沉积的过程。器官纤维化的病理生理机制尚未阐明，Smads信号分子的激活在器官纤维化过程中发挥着重要作用。现就Smads蛋白与器官纤维化疾病的研究进展予以综述。

1 Smads蛋白家族的组成及其信号转导

Smads蛋白家族由转化生长因子（transforming growth factor，TGF）超家族成员内具有信号转导功能的多种转录因子组成，属于TGF超家族的亚家族，其命名源于最初发现的两种蛋白，即Drosophilamothers againstdpp（Mad）和 C．elegans Sma 的融合［1］。到目前为止，哺乳动物Smads蛋白家族已经发现了8个成员，根据在信号传递过程中的作用，分为三大类:① 受体激活性 Smads（receptor-activated Smads，R-Smads），包括 Smad1、2、3、5、8，主要存在于细胞质中，激活后可进入细胞核。其中Smad1、5、8主要由骨形成蛋白激活，而Smad2、3主要由TGF-β、激活素激活。② 通用性 Smad（common mediator Smads，Co-Smads），即 Smad4，为 R-Smads的伴侣，分布于细胞质和细胞核。Smad4与R-Smads结合形成异二聚体，介导R-Smads核转位。③ 抑制性Smads包括，Smad6和Smad7，是信号转导的负反馈调节分子，主要分布于细胞核中。

Smads蛋白相对分子质量为（42～60）×103，由三个部分组成:①MH1区，即高度保守的氨基端，约130个氨基酸，是信号转导的抑制性结构域。②MH2区，即高度保守的羧基端区，约200个氨基酸，主要与Smads蛋白二聚体的形成及核转运相关。在基础状态下，MH2区被MH1区抑制，使Smads蛋白处于非活化状态。③L区，即MH1和MH2之间链接区，与Smads蛋白同聚体的形成有关，其长度和序列多变。当受到外界信号（如TGF-β、AngⅡ、AGEs等）刺激时，R-Smads MH2区中的受体磷酸化位点（SsxS模序，即set-set-x-ser序列）激活，丝氨酸发生磷酸化，即解除MH1区的抑制作用，此过程即为R-Smads的激活。活化后的R-Smads构型改变，迅速与Smads锚着蛋白分离，而与Co-Smads结合形成异二聚体进入细胞核内。在核内，Smad3和Smad4可与DNA核苷酸序列上的Smads结合元件（即5'-GTCTA GAC-3'）特异性结合，Smad2由于MH1结构域被修饰，不能与Smads结合元件结合，而与Smad4共同结合至DNA复合体中。Smads蛋白可以通过与转录共激活因子共同作用，促进基因的表达，还可以结合转录共抑制因子，下调基因的转录。在此过程中，还需要其他转录因子（如转化生长影响因子、造血细胞分化调控基因、Smads核转录共抑制因子等）辅助参与。细胞质中Smads蛋白的降解可以通过核小体和泛素蛋白酶途径进行。

一系列研究表明，Smads蛋白是参与细胞的生长、增殖、凋亡、形态发生、免疫反应等过程中的重要信号分子，参与了多种器官纤维化过程，如心肌纤维化［2］、肾纤维化［3］、血管纤维化［4］等。

2 Smads与器官纤维化的关系

实质器官纤维化的发生过程可概括为三个步骤:①损伤后上皮细胞大量产生、释放并激活细胞因子（如白细胞介素6、白细胞趋化蛋白1等）使炎性细胞向原始损伤部位募集;②炎性浸润细胞进一步分泌细胞因子，损伤上皮实质器官，并且刺激成纤维细胞增殖，产生基质蛋白;③当原始伤害刺激因素和炎症减退后，损伤部位的生物合成反应（细胞外基质合成）的自我激活和持续是纤维化形成的关键［5］。

2．1 Smads与心肌纤维化 心脏主要用由心肌细胞和心肌间质组成。心肌间质包括非心肌细胞（主要是成纤维细胞）和细胞外基质，后者85%由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成，由心肌成纤维细胞合成和分泌［6］。心肌纤维化指心肌组织中胶原纤维过量沉积，各型胶原比例失调、排列紊乱，是心肌重构的主要表现之一，为各种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变。心肌成纤维细胞大量增殖、合成胶原是心肌纤维化进展的重要特征，多种活性因子能够激活心肌成纤维细胞，促进心肌纤维化的发展，其中最主要有肾素-血管紧张素-醛固酮系统、TGF-β1，其他活性因子包括内皮素、尾加压素Ⅱ、肝细胞生长因子、基质金属蛋白酶、血小板衍化生长因子等。然而，这些活性因子促进心肌纤维化的机制仍未完全阐明，而Smads信号分子的作用受到广泛的关注。

有报道［7］，在心肌梗死后，TGF-β、Activin 等表达水平升高，同时伴有Smad2、3、4的激活。在高胆固醇饮食诱导心肌纤维化模型中，TGF-β表达上调，其下游信号Smads蛋白相应增加，同时胶原合成增多，ColⅠ/Ⅲ增加，凋亡细胞增多，心肌出现典型纤维化特征。体外研究发现［8］，TGF-β 介导的 Smads蛋白的磷酸化可以诱导心脏造血干细胞向成纤维细胞分化，而心脏造血干细胞是自身免疫性心肌炎中TGF-β诱导心肌纤维化的主要靶点。另外，小鼠主动脉缩窄术后，TGF-β 上调［9］，从而激活 Smad2/3和Smad1/5信号，诱导基质蛋白产生。这都提示了TGF-β/Smad信号通路的激活在心肌纤维化过程中发挥重要作用。最近报道［10］，可溶性TGFβⅢ型受体可以抵抗 TGF-β诱导的 Smad2/3的活化，阻断Smads信号转导通路，抑制肌成纤维细胞分化，抑制心肌纤维化。

AngⅡ也可通过激活Smads信号途径促进心肌纤维化的过程。AngⅡ能够刺激p-Smad2/3和Smad4的表达，还能够诱导TGF-β产生、协同TGF-β作用，促进纤维化发展，该效应可以被AngⅡ1型受体阻断剂氯沙坦抑制，提示Smads激活是AngⅡ介导心肌纤维化的重要机制之一。在Smad3野生型和基因剔除型小鼠上，AngⅡ能诱导血压升高［11］，Smad3野生型组同时伴有 TGF-β、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、ColⅠ/Ⅲ、α 平滑肌肌动蛋白表达上调，然而，Smad3基因剔除型组并无此变化。提示Smad3在心肌纤维化和心肌重塑中起关键作用。与此同时，在p-Smad2/3表达升高的同时，伴随着核因子κB/p65表达增高，提示核因子κB/p65可能是Smads信通路介导纤维化过程的一个重要的中介分子。

此外，Smads信号通路在糜酶［12］、雷帕霉素靶蛋白［13］和心肌细胞凋亡信号转导［14］中也发挥了重要的作用，参与糜酶、雷帕霉素靶蛋白和心肌细胞凋亡、心肌纤维化。

但是，近来有研究提示，Smads信号通路在心肌纤维化中扮演了另外一种角色。Divakaran等［15］采用Smad3－/－小鼠制作主动脉缩窄后左心室压力超荷模型，发现小鼠死亡率显著提高，认为可能与Smad3缺失引起的恶性心律失常有关，但具体机制尚不清楚。同时还发现，Smad3－/－小鼠主动脉缩窄后心重指数（心重/体质量比）、左心室厚度以及肌细胞横断面积均明显上升，出现向心性肥大。提示Smad3可能在限定心肌细胞肥大中发挥了重要作用。国内学者也发现，AngⅡ能够诱导心肌成纤维细胞上Smad7合成增加。Smad7是一个心脏的保护因子，基因上含有与Smad3～Smad4结合的序列，可因R-Smads激活后数小时内被诱导产生，从而抑制Smad2/3磷酸化，通过负反馈机制抑制心肌纤维化。对于AngⅡ诱导心肌成纤维细胞上Smad7的产生可能是一种代偿性升高。这可能为研究Smads蛋白在促进或者逆转心肌纤维化中的信号机制提供一种新的启示。

2．2 Smads信号通路与肾间质纤维化 肾间质纤维化的机制相当复杂，其中肾脏细胞外基质生成细胞（包括肾间质成纤维细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞）发挥着重要作用。在氧自由基、细胞因子等损害因素刺激下，这些细胞发生增殖，合成大量细胞外基质，堆积于肾间质，导致肾小球硬化和间质纤维化，是各种肾脏疾病发展到肾衰竭的共同通路和病理基础［16］。许多证据表明，上皮-间质转化（epithelial tomesenchymal transition，EMT）是肾纤维化的一个关键的机制［4］。与EMT相关的信号机制主要有TGFβ/Smads，整合素/整合素连接激酶和 Wnt/βcatenin信号通路［16］。其中，TGF-β 是目前认为的最强的促肾纤维化因子，而Smads蛋白是目前发现的TGF-β主要作用底物，能够把TGF-β信号从细胞外传递到细胞核。很多EMT相关基因（如CTGF、整合素连接激酶、β1整合素、Wnt、Snail、Id1、α 平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶 2［4］）是 TGF-β/Smads 信号的作用靶点。

Sebe等［17］发现TGF-β促进猪的近曲小管上皮细胞上Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平上调。其他学者发现［18］，Wistar大鼠体内注射 AngⅡ 24 h后Smad3蛋白磷酸化水平明显升高，该作用可持续至2周。在体外培养的肾小管上皮细胞上［19］，AngⅡ分别刺激15 min和24 h，发现Smad2/3蛋白磷酸化水平明显上调，早期（15 min）通过AngⅡ1型受体-细胞外信号调节激酶/p38-Smads信号通路，而迟发相通过（24 h）AngⅡ1型受体-TGF-β-Smads信号途径来实现。Smad2/3活化后，又进一步激活下游的CTGF、ColⅠmRNA和蛋白表达。Smads激活进入细胞核后，与Snail和EMT转录相关因子1等结合，调节其下游EMT相关基因转录［1］，如促进间质细胞和肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白、波形蛋白表达上调，而内皮细胞标志物上皮钙黏蛋白表达明显减少［17，18］，提示 Smads 介导了 AngⅡ诱导的 EMT过程。有学者分别对Smad2和Smad3进行RNA干扰，发现干扰Smad3 RNA表达后可以抑制AngⅡ诱导的CTGF和ColⅠ的表达［19］。另外，体内外实验都发现［4，17］，Smad3 基因缺失可以抑制 EMT 相关基因转录，抵抗EMT，减轻肾纤维化，提示Smad3在介导肾脏EMT和肾纤维化中起关键作用。

与Smad2/3相反，Smad7可以抑制EMT、抵抗肾纤维化。细胞内转染Smad7可以拮抗Smad2/3的磷酸化，抑制其下游 CTGF和ColⅠ的表达［19］，并能抑制TGF-β诱导的α平滑肌肌动蛋白的表达［17］、抑制EMT。在肾脏疾病中，Smads的激活不仅与TGF-β上调有关，还与Smads的降解和调节因子有关［4］。

2．3 Smads与血管纤维化 血管纤维化表现为细胞外基质异常增多，过度沉积和基质重塑，导致血管管径缩小和（或）管壁增厚，是高血压、糖尿病等的主要并发症。肾素-血管紧张素-醛固酮系统、内皮素、尾加压素Ⅱ、TGF-β、CTGF、白细胞趋化蛋白1和血小板源生长因子等的激活与血管纤维化密切相关。另外，血管纤维化也与干扰素 γ、成纤维细胞生长因子2、一氧化氮以及基质金属蛋白酶等抑制和降解基质合成的因子失调有关。

Smads信号分子的激活在血管纤维化发生过程中亦发挥关键作用。有报道［20］，在高血压动脉硬化患者肾动脉胶原沉积和纤维发展过程中，TGF-β通过激活Smads可以上调细胞外基质相关基因（如前胶原、纤连蛋白、CTGF）表达。此外，体内和体外实验均发现［21］，AngⅡ能够激活大鼠主动脉 Smad2/4，促进p-Smad2核转位，增强其下游CTGF启动子活性，升高基因蛋白水平。该效应可以被氯沙坦和p38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580部分阻断。转染Smad7可以阻断TGF-β诱导的纤连蛋白、胶原和CTGF的表达。有研究证实AngⅡ可通过TGF-β依赖性和非依赖性途径激活血管平滑肌细胞中Smads信号通路，参与血管纤维化［5］。此外，AGEs能够激活 Smad2/3［22］，增加胶原合成，即使在 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ突变细胞中也存在上述现象，该效应可被细胞外信号调节激酶/p38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂阻断，提示糖基化终末产物能够直接刺激Smads，并且促分裂原活化蛋白激酶和Smads之间的串话可能在糖尿病血管病变中发挥关键作用。

另外，Smads信号在血管外膜细胞参与血管纤维化过程中也发挥了重要作用。有报道TGF-β1能够激活血管外膜成纤维细胞上Smads信号分子，并与促分裂原活化蛋白激酶以及整合素信号分子之间具有串话效应［23］。也有研究发现，过表达Smad7可减弱血管球囊扩张术后血管外膜细胞的迁移和胶原沉积，从而减轻血管纤维化［24］。

由此可见，Smads信号在血管纤维化中担当着重要的角色。但在此过程中，Smad2和Smad3可能发挥了不同的作用。有报道Smad3缺失的血管平滑肌细胞中［5］，AngⅡ介导的血管纤维化作用消失，而Smad2缺失并无此效应。也有发现异位表达的Smad3可以协同TGF-β诱导纤连蛋白表达［25］，提示Smad3在血管纤维化中起了关键的作用。

3 结语

Smads信号与器官纤维化有着密切的关系。Smads不同亚型在促器官纤维化过程中担当着不同的角色。以Smad 2、Smad 3为代表的R-Smads是纤维化疾病的正调控因子，以Smad 7为代表的I-Smads是纤维化疾病的负调控因子。靶向阻断Smad 2、Smad 3蛋白的磷酸化或提高Smad 7表达以阻断TGF-β、AngⅡ、AGEs等信号转导通路，有望为器官纤维化疾病的临床治疗提供一种新的途径。

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