黑柄炭角菌水溶性多糖XNW-1的分离纯化与结构分析

周蓉，尹军华，翁榕安，陈作红

（湖南师范大学生命科学学院，中国长沙 410081）

黑柄炭角菌水溶性多糖XNW-1的分离纯化与结构分析

周蓉，尹军华，翁榕安，陈作红*

（湖南师范大学生命科学学院，中国长沙 410081）

黑柄炭角菌发酵菌丝经热水浸提、Sevag法脱蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE－52纤维素层析和Sephadex G－100凝胶层析等分离纯化，得到黑柄炭角菌多糖组分XNW－1，紫外扫描检测和Sephadex G－100分析表明XNW－1为均一组分，相对分子质量9.0×105.单糖组成分析表明XNW－1只含葡萄糖.XNW－1的糖含量为96%.红外光谱、GC－MS、1H和13C核磁共振结构分析表明:XNW－1由α型糖苷键构成，（1→4）葡萄糖（82%）的连接方式，构成主链的核心;其他连接方式包括（1→4，6）葡萄糖（12%），（1→6）葡萄糖（1%），末端（1→）连接葡萄糖（5%）;末端糖基所占比重不大，说明XNW－1为低分支结构.

黑柄炭角菌;多糖;分离纯化;结构分析

黑柄炭角菌［Xylaria nigripes（Klotzsch）Sacc.］是子囊菌亚门（Ascomycotina），炭角菌科（Xylariaceae）的一种名贵药用真菌，别名乌灵参.具有除湿、镇静安神、造血以及提高机体免疫功能等功效［1］.有关黑柄炭角菌的药理报道较多并已经被开发成药物进入临床应用［2－4］，但对于黑柄炭角菌中的有效活性成分研究不多，陈宛如等对其基本的氨基酸、腺苷、多糖、维生素等组成成分进行了初步分析［5］;廖琼等对黑柄炭角菌不同组织的核苷成分进行了HPLC测定［6］;吴根福从黑柄炭角菌深层发酵制品中获得了具有DPPH自由基捕捉活性成分，推断它为5，8二羟基3甲基3，4二氢异香豆素［7］;龚庆芳等从黑柄炭角菌发酵菌丝中分离得到9个化合物，其中化合物1－（2，6－二羟基苯）－3－羟基－丁酮具有很强的清除自由基能力和还原力［8－9］.关于黑柄炭角菌多糖的分离纯化和结构分析目前未见文献报道.本文选取黑柄炭角菌菌丝体水溶性多糖为研究对象，对其进行分离纯化和结构特征分析，为进一步研究其药理作用提供科学依据.

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

黑柄炭角菌菌丝体发酵培养条件参照朱志雄等［10］的方法，由湖南师范大学生命科学学院真菌研究室提供;DEAE－52纤维素柱、Sephadex G－100和Sepharose CL－6B均为瑞典Pharmaci公司;各种标准单糖、糖醇、TMS均为色谱纯，购自美国Sigma公司;其他试剂均为分析纯.

1．2 仪器与设备

WD－9403C紫外分析仪、752紫外光栅分光光度计，上海精密仪器有限公司;透析袋（截流范围8 000～15 000）Green Bird公司;R－200旋转蒸发仪，瑞典BUCHI公司;Lambda Bio40紫外光谱仪，Avatar 370 FT－IR红外光谱仪，美国Thermo公司，BrukerAMX－400和DRX－500 MHz核磁共振波谱仪（TMS为内标）美国，Varian 3400气相色谱仪（附FID检测器），美国;色（气）质联机HP5890（Ⅱ）GC/HP5988MS，美国安捷伦公司.

1．3 方法

1.3.1 多糖的提取与纯化发酵菌粉粉碎→95%乙醇脱脂6 h→95～100℃水浴加热浸提3 h→重复浸提2次，合并滤液→减压浓缩→乙醇沉淀（95%，3倍体积）→离心分离（5 000 r/min，8 min）→沉淀用无水乙醇洗涤2次→真空冷冻干燥得水溶性粗多糖XNW→Sevag法脱蛋白→上清液流水透析3 d→加95%乙醇至糖液浓度为30%→沉淀离心→真空冷冻干燥得脱蛋白多糖XNW→DEAE－52纤维素柱层析（洗脱液分别用蒸馏水、0.1 mol/L NaCl分段梯度洗脱，柱规格为20 mm×500 mm，每管收集6 mL）→苯酚－硫酸法逐管检测多糖含量→分别合并主糖峰，浓缩冻干，依次得2个多糖组分XNW－1和XNW－2→XNW－1进一步进行Sephadex G－100（1.5 cm×70 cm）柱层析色谱（蒸馏水洗脱，收集条件为每管收集约5 mL/10 min）→苯酚－硫酸法逐管检测多糖含量→收集洗脱峰部位的洗脱液，合并浓缩冻干→纯化的多糖XNW－1.

1.3.2 多糖的纯度检测和含量测定紫外扫描检测将收集得到的多糖XNW－1取少量溶解，采用紫外光谱仪在200～400 nm之间扫描，观察260 nm、280 nm处是否有吸收峰.

苯酚－硫酸法测定XNW－1的吸光度，查标准曲线求XNW－1的糖含量.

1.3.3 多糖的理化性质分析真空干燥XNW－1粉末呈白色，各取适量分别溶于冷水、热水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等溶剂检测溶解度.XNW－1加碘液反应，检测是否为淀粉性葡聚糖.

1.3.4 多糖的相对分子质量测定［11］采用凝胶柱层析法，样品XNW－1和Dextran系列经Sepharose CL－6B洗脱后，根据洗脱峰的形状判断样品XNW－1的纯度，以Dextran系列标准品的分子量对数与洗脱体积作图得标准曲线，再根据峰值管洗脱体积查标准曲线获得样品XNW－1相对分子质量洗脱体积求得的相对分子质量.

1.3.5 单糖组成分析取纯化后的多糖组分5 mg，倒入具塞试管，加2 mL 1 mol/L的三氟乙酸，封管于120℃水解2 h，减压蒸干，溶于水，进行样品XNW－1及标准品（葡萄糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖）硅胶薄层色谱分析，由斑点确定样品的单糖组成.

1.3.6 甲基化反应［12－13］称取20 mg彻底干燥糖样XNW－1，溶于6 mL二甲亚砜（DMSO，以4Å分子筛脱水），充N2封管后，40℃磁力搅拌至糖样充分溶解（15 h）.加入6 mL NaOH－DMSO混悬液（将240 mg 0.178 mm过筛的NaOH（70℃真空干燥）与6 mL DMSO在匀浆器中混合，充N2密封，25℃磁力搅拌，使其成为均匀的混悬液）和3.6 mL碘甲烷，密封，磁力搅拌7 min后加入6 mL蒸馏水以终止反应.将其装入透析袋内，用流水和蒸馏水各透析24 h，以氯仿萃取3次，合并氯仿层，用蒸馏水洗3次，无水Na2SO4干燥24 h，过滤，蒸除氯仿至1 mL左右，用红外光谱仪检查在3 400 cm－1处无—OH吸收峰.向甲基化多糖中加入85%甲酸1 mL后充N2封管，100℃水解4 h，无水乙醇驱酸后真空干燥，再加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，100℃水解6 h，再用无水乙醇驱酸后，加入NaBH4还原，乙酰化，干燥，用少量氯仿溶解后进行GC－MS分析.

1.3.7 NMR分析核磁共振的1H－NMR谱是用BrukerAMX－400核磁共振仪测定（TMS为内标，D2O为溶剂）;13C－NMR谱是用DRX－500 MHZ测定（DSS为内标，D2O为溶剂）.

1.3.8 多糖的糖链中糖苷键及糖环构型确定红外光谱分析:取10 mg干燥的XNW－1进行溴化钾（KBr）压片，在傅立叶红外光谱仪中测定IR图，扫描波长为4 000～400 cm－1.

2 结果与分析

2．1 XNW-1分离纯化及基本理化性质

黑柄炭角菌粗多糖经Sevag法脱蛋白、透析、乙醇沉淀、DEAE－52纤维素柱层析及Sephadex G－100凝胶柱色谱分离纯化得到均一多糖XNW－1（图1）.XNW－1呈白色粉末状，无气味，较难溶于冷水，易溶于热水，其水溶液浓度大时呈透明胶稠状，易被醇、酮等有机溶剂析出.XNW－1遇碘液不变色，说明为非淀粉性多糖;平均相对分子质量为9×105.

XNW－1的紫外扫描结果（图2）表明，只有在200 nm左右显示多糖吸收峰，无260 nm处的核酸吸收峰和280 nm处的蛋白质吸收峰.说明纯化所得的XNW－1不含核酸和蛋白质.经苯酚－硫酸法测定XNW－1的糖含量为96%.

图1 XNW－1的Sephadex G－100柱色谱图

图2 XNW－1的紫外光谱检测

2．2 XNW-1的单糖组成分析

经过完全酸水解和薄层层析（见图3）可以看到各种单糖在苯胺－二苯胺试剂的显色作用下呈色情况分别为葡萄糖:暗蓝灰色，果糖:紫灰色，鼠李糖:棕褐色，半乳糖:灰色，阿拉伯糖:棕绿色，木糖:棕绿色.XNW－1只有单一暗蓝灰色斑点，说明只含葡萄糖.

图3 多糖XNW－1酸水解薄层层析图

2．3 红外光谱分析

XNW－1红外光谱分析（图4）表现出一般多糖类物质的特征吸收峰:XNW－1的849 cm－1为α构型吡喃糖才具有，3 408 cm－1处的宽峰为—OH伸缩振动峰，2 927 cm－1处为C—H，1 648 cm－1左右有C—O非对称伸缩振动峰，1 200 cm－1～1 000 cm－1处有3个吸收峰，为C—O—H和C—O—C的吸收峰，证明是吡喃糖.

图4 XNW－1的红外光谱图

2．4 甲基化分析

XNW－1经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到部分甲基化的糖醇乙酸酯，进行GC/MS色质联机分析后，通过对照质谱谱库中的标准质谱图，得到甲基化分析结果（图5～6），分析列于表1和表2.

图5 甲基化XNW－1气相分析

图6 甲基化XNW－1气质联用分析

表1 XNW－1甲基化产物分析

表2 XNW－1单糖摩尔比和糖苷键

由表1和表2可知:XNW－1中主要连接方式为1→4连接葡萄糖，所占比例为82%，其他连接方式1→6连接葡萄糖占12%，1→4，6连接葡萄糖占1%，末端1→连接葡萄糖占5%.末端葡萄糖占总糖基量的1/20，有一定比例，说明多糖XNW－1具有一定的分支结构.

2．5 NMR分析

XNW－1的1H－NMR和13C－NMR谱图如图7和图8，根据图7可知，XNW－1的C－1质子的δ值都超过5.0×10－6，都为α型吡喃己糖.从图8可以看出:C－1的信号有101.851×10－6和99.879×10－6，表明多糖的异头碳的构型仅为α－构型，且分别指α－Glc（1→4），α－Glc（1→6）;C－4的取代位移信号有81.133×10－6和80.458×10－6，分别指Glc（1→4，6）和Glc（1→4）;69.418×10－6表示C－6有被取代的，而60.613×10－6和60.296×10－6则是未被取代的C－6的信号.

图7 XNW－1氢谱图

图8 XNW－1碳谱图

3 结论

以黑柄炭角菌菌丝体为原料，分离纯化后得水溶性多糖XNW－1.XNW－1呈白色粉末状，含糖量96%，平均相对分子质量9.0×105.XNW－1经水解、薄板层析，红外光谱和核磁共振分析确定其由葡萄糖组成，糖环构型为吡喃型，主要由α型糖苷键构成，（1→4）葡萄糖（82%）的连接方式，构成主链的核心;其他连接方式包括（1→4，6）葡萄糖（12%），（1→6）葡萄糖（1%），末端（1→）连接葡萄糖（5%）;末端糖基所占比重不大，说明XNW－1为低分支结构.

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Isolation，Purification and Structure Analysis of Water-Soluble Polysaccharides of Xylaria Nigripes

ZHOU Rong，YIN Jun-hua，WENG Rong-an，CHEN Zuo-hong*
（College of Life Science，Hunan Normal University，Changsha 410081，China）

The polysaccharide XNW－1 was isolated from the fermented mycelium of Xylaria nigripes （Klotzsch）Sacc.through hot－water extraction and subjected to Sevag deprotein，dialysis，ethanol precipitation，DEAE－52 cellulose ion－exchange column chromatography and Sephadex G－100 column chromatography.This polysaccharide was found to be highly homogeneous with a relative molecular mass of 9.0×105.Analysis of monosaccharide composition revealed XNW－1 were only made up of glucose.The total sugar content of XNW－1were 96%. The chemical structure of XNW－1 was analyzed by IR，GC－MS，1H－NMR，and13C－NMR.These results indicated that XNW－1 has the following structure:XNW－1 is mainly made up of α configuration glycosidic，its basic structure was composed of major（1→4）linked glucose（82%），other linkages including（1→4，6）glucose（12%），（1→6） glucose（1%）and terminal（1→）glucose（5%）.XNW－1 was a kind of lowly branched structure.

Xylaria nigripes;polysaccharide;isolation and purification;structural analysis

S567;R284

A

1000－2537（2011）05－0075－05

2011－04－22

湖南省教育厅重点资助项目（08A044）

*通讯作者，E－mail:chenzuohong@263.net

（编辑王健）