杂色云芝菌产漆酶条件优化及其对碱性紫5BN的降解

尹将来，马 瑛，贾红华，周 华，韦 萍

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 210009)

杂色云芝菌产漆酶条件优化及其对碱性紫5BN的降解

尹将来，马 瑛，贾红华，周 华，韦 萍

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 210009)

通过实验对杂色云芝菌产漆酶的发酵条件进行了优化，结果表明杂色云芝菌产漆酶的最佳发酵条件为:以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠和质量浓度为1.25 g/L的葡萄糖作为复合碳源，以质量浓度为15 g/L的酵母膏作为氮源，在发酵72 h时加入浓度为2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，发酵96 h时加入浓度为2 mmol/L的Cu2+。发酵培养168 h后酶活力达到3 319.2 U/mL。采用该菌株产漆酶对碱性紫5BN溶液进行脱色处理，当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时，反应10 h，脱色率可达93.91%。

云芝菌;漆酶;发酵;碱性紫5BN;脱色

漆酶［1－3］是一种含铜的多酚氧化酶，最早由日本人吉田于1883年从漆树汁液中发现并因此得名，直至1985年被法国人Bertrand确定为含金属的氧化酶类［4］。漆酶广泛分布于真菌、高等植物和昆虫中，特别是在一些真菌，如担子菌、多孔菌、子囊菌等中发现的较多。此外，在一些高等动物中也发现了漆酶，如Manuel等［5］从牛胃中鉴定获得一新的漆酶。

随着工业技术的发展，染料废水因色度高、碱性大、难降解、水量大等特点成为较难治理的工业废水［6－8］。碱性紫5BN作为三苯甲烷类染料，被广泛应用于纺织、印染、油墨等工业领域。采用物化法降解碱性紫5BN运行费用高，药剂加入量大，且产生大量难处理的污泥［9－10］。酶催化反应由于反应条件温和、反应效率高、操作范围宽，受到越来越多研究者的关注。漆酶在催化过程中产生的惟一副产物是水，因此成为环境保护用酶的研究热点［11－13］。目前，国内外对于漆酶降解废水中有机物的研究展开了大量的工作，并将其应用于难降解工业有机废水的治理［14－16］。漆酶的主要生产菌株是大型丝状真菌担子菌中的白腐菌，这些菌株普遍存在产酶周期长、产酶量低等问题，使得漆酶的规模化应用受到限制［17］。

本课题组分离得到一株漆酶生产量高、生长速率快、易培养的杂色云芝菌(Coriolus Versicolor)。本工作对该菌产漆酶的培养基进行优化，并使用粗酶液对染料碱性紫5BN进行降解研究，为漆酶工业化生产及绿色应用奠定了基础。

1 实验部分

1.1 试剂、材料和仪器

实验用试剂均为分析纯。

杂色云芝菌由本实验室筛选保藏。

斜面培养基(质量浓度，g/L):麦芽汁30，蛋白胨3，琼脂20。斜面培养基pH 5.6。

种子培养基(质量浓度，g/L):麦芽汁30，蛋白胨3。种子培养基pH 5.6。

初始发酵培养基(质量浓度，g/L):葡萄糖15，酵母膏5，KH2PO41，MgSO40.25，CaCl20.05。初始发酵培养基pH 3.5。

HVE－50型高压灭菌锅:日本Hirayama公司;752型紫外－可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;GL－21M型冷冻离心机:上海市离心机械研究所。

1.2 漆酶粗酶液的制备

斜面培养:将保存的菌种接种于斜面培养基上，于25℃恒温培养3 d，置于4℃冰箱中保存备用。

种子培养:用灭菌后的竹签将斜面上的菌丝刮到含有玻璃珠的30 mL无菌水中，将其打散，然后吸取2 mL菌悬液加入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在25℃、转速为160 r/min的条件下，摇床震荡培养3 d。

平遥县2014年汾河灌区渠系配套项目实施区域主要位于县城西北部，涉及5个乡镇8个行政村，包括四个片区。一是香乐乡北薛靳、青落、陶屯、云家庄村4村；二是宁固镇净化、魏乐2村；三是古陶镇新庄村；四是洪善镇新营村。

发酵培养:将培养好的种子以4%(体积分数)的接种量接入到发酵培养基中，在30℃、转速为180 r/min的条件下，摇床震荡培养一定时间。

取适量发酵液在4℃、转速为10 000 r/min的条件下离心10 min，得到上清液即为漆酶粗酶液。

1.3 碱性紫5BN溶液的脱色实验

将初始质量浓度为10 mg/L的碱性紫5BN溶液加入到一定酶活力的漆酶粗酶液中，在反应温度为40℃、pH为3的条件下进行脱色反应。

1.4 分析方法

采用2，2'－连氮 －双(3－乙基并噻 －6－磺酸)(ABTS)法测定酶活力(单位体积酶液中每1 min转化 1 μmol ABTS 的酶量，U/mL)［18－19］;采用紫外－可见分光光度计在最大吸收波长589 nm处测定碱性紫5BN溶液的吸光度，并计算溶液脱色率。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养时间对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响

在采用初始发酵培养基配方的条件下，发酵培养时间对漆酶酶活力的影响见图1。由图1可见:随发酵培养时间的延长，漆酶酶活力先增大后减小;杂色云芝菌在发酵培养168 h后漆酶酶活力达到最高值。说明杂色云芝菌在发酵培养168 h后逐步进入了衰亡期。因此，将杂色云芝菌漆酶的发酵培养时间确定为168 h。

2.2.1 单一碳源对漆酶酶活力的影响

改变初始发酵培养基中碳源的配方，考察不同碳源对漆酶酶活力的影响，实验结果见图2。由图2可见:以麦芽糖作为碳源时，漆酶酶活力最低;以羧甲基纤维素钠作为碳源时漆酶酶活力最高，培养168 h后酶活力达37.5 U/mL。这可能是因为复杂碳源更有利于杂色云芝菌产漆酶。

2.2.2 复合碳源对漆酶酶活力的影响

多糖难以被直接利用，影响菌体生长，但有利于漆酶的分泌;相反单糖则有利于菌的吸收，但不利于漆酶的分泌。因此以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠与质量浓度为2 g/L的其他碳源组成复合碳源，考察不同复合碳源对漆酶酶活力的影响，实验结果见图3。由图3可见:分别以葡萄糖和蔗糖与羧甲基纤维素钠形成复合碳源时的漆酶酶活力较高;其中以葡萄糖和羧甲基纤维素钠作为复合碳源时，培养168 h后产漆酶酶活力可达51.5 U/mL。

以葡萄糖和羧甲基纤维素钠作为复合碳源，在羧甲基纤维素钠质量浓度为15 g/L的条件下，ρ(羧甲基纤维素钠)∶ρ(葡萄糖)对漆酶酶活力的影响见图4。由图4可见:随ρ(羧甲基纤维素钠)∶ρ(葡萄糖)的增加，漆酶酶活力先增大后减小;当ρ(羧甲基纤维素钠)∶ρ(葡萄糖)为12时，产漆酶酶活力最高达134.5 U/mL。这是由于葡萄糖作为单糖有利于杂色云芝菌的生长而被优先利用，导致羧甲基纤维素钠的利用过程滞后;随羧甲基纤维素钠质量浓度的增加，过多的羧甲基纤维素钠使培养基的黏性增加，影响其溶氧量，不利于菌体的生长产酶。因此确定复合碳源的最佳配方ρ(羧甲基纤维素钠)∶ρ(葡萄糖)为12，即羧甲基纤维素钠的质量浓度为15 g/L，葡萄糖的质量浓度为1.25 g/L。

图4 ρ(羧甲基纤维素钠)∶ρ(葡萄糖)对漆酶酶活力的影响

2.3 氮源对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响

改变初始发酵培养基中的氮源——酵母膏的质量浓度，考察酵母膏质量浓度对漆酶酶活力的影响，实验结果见图5。由图5可见，当酵母膏质量浓度为15 g/L时，漆酶酶活力最高。

图5 酵母膏质量浓度对漆酶酶活力的影响

2.4 诱导剂对杂色云芝菌产漆酶酶活力的影响

2.4.1 不同诱导剂对漆酶酶活力的影响

漆酶是一种诱导酶［20］，在发酵培养基中添加小分子芳香化合物作为诱导剂可促进漆酶的分泌，提高漆酶产量。在诱导剂加入量为2 mmol/L的条件下，不同诱导剂对漆酶酶活力的影响见图6。由图6可见，以2，5－二甲基苯胺作为诱导剂对杂色云芝菌分泌漆酶的诱导作用最明显，发酵168 h后漆酶酶活力达到2 305.0 U/mL，是不加诱导剂时的4.4倍。

2.4.2 Cu2+和诱导剂的加入时间对漆酶酶活力的影响

在杂色云芝菌生长前72 h加入诱导剂2，5－二甲基苯胺会明显抑制菌株的生长发育，同时产漆酶的能力也会受到影响。这是因为芳香化合物对菌体的生长有明显的抑制作用，因此选择适当的加入时间十分重要。研究还表明适量加入Cu2+对真菌产漆酶有一定的促进作用。在Cu2+和诱导剂加入量均为2 mmol/L的条件下，Cu2+和诱导剂的加入时间对漆酶酶活力的影响见图7。由图7可见，在发酵72 h时加入2，5－二甲基苯胺、发酵96 h时加入Cu2+对杂色云芝菌产漆酶的诱导作用最明显，发酵168 h后酶活力达到3 319.2 U/mL。

2.5 漆酶对碱性紫5BN溶液的脱色作用

漆酶粗酶液酶活力对脱色率的影响见图8。

由图8可见，随漆酶粗酶液酶活力的增加，染料溶液的脱色率逐渐降低。这是由于过多的漆酶与小分子介质反应，不仅减少了参与脱色作用的漆酶的量，同时也使ABTS丧失了作为小分子介质促进反应的能力。当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时，反应10 h，脱色率可达93.91%。

3 结论

a)通过对杂色云芝菌进行发酵培养生产漆酶。实验结果表明杂色云芝菌产漆酶的最佳发酵条件为:以质量浓度为15 g/L的羧甲基纤维素钠和质量浓度为1.25 g/L的葡萄糖作为复合碳源，以质量浓度为15 g/L的酵母膏作为氮源，在发酵72 h时加入浓度为2 mmol/L的2，5－二甲基苯胺，发酵96 h时加入浓度为2 mmol/L的Cu2+。发酵培养168 h后，酶活力达到3 319.2 U/mL。

b)采用所制备的漆酶粗酶液对碱性紫5BN溶液进行脱色处理，当漆酶粗酶液酶活力为0.01 U/mL时，反应10 h，脱色率可达93.91%。

［1］ Susana R C，José L T H.Industrial and biotechnological application of laccase:A review［J］.Biotechnol Adv，2006，24:500 －513.

［2］ Alfred M M，Richard C S.Laccase:new functions for an old enzyme［J］.Phytochemistry，2002，60:551 －565.

［3］ 王佳玲，余惠生，付时雨，等.白腐菌漆酶的研究进展［J］.微生物学通报，1998，25(4):233 －235.

［4］ Bertrand G C R.Sur la laccase et sur le pouvoir oxidant de cette diastase［J］.Cr Acad Sci，1985，120:266 －269.

［5］ Manuel F，Beloqui A，Polaina J，et al.Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of bovine rumen － Biochemical properties，structural analysis，and phylogenetic relationships［J］.J Biol Chem，2006，281(32):22933－22942.

［6］ 陈刚，黄满红，陈晔，等.厌氧生物降解活性黑KNB5［J］.化工环保，2010，30(3):192 －195.

［7］ 董俊明，陈晓阳.TiO2/GeO2复合膜光催化处理活性蓝染料废水［J］.化工环保，2009，29(6):518－521.

［8］ 钱伯章，朱建芳.石油化工废水处理技术新发展［J］.化工环保，2009，29(2):99－104.

［9］ 巩林，刘勇，任小蓉，等.天然蛭石对结晶紫的吸附性能研究［J］.化工环保，2010，22(1):115－119.

［10］ Samaik S，Kanekar P.Biodegradation of methyl violet by pseudomonas mendoe in a MCMB-402［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，52:251 －254.

［11］ Matera I，Gullotto A，Tilli S，et al.Crystal structure of the blue multicopper oxidase from the white-rot fungus trametes trogii complexed with p-toluate［J］.Inorg Chim Acta，2008，361(14):4129－4137.

［12］ Kunamneni A，Plou F J，Ballesteros A，et al.Laccases and their app lications:A patent review［J］.Recent Pat Biotechnol，2008，2(1):10 －24.

［13］ 陈新芳，刘伟，田云苗，等.辣根过氧化物酶催化氧化法处理含油废水［J］.化工环保，2007，27(1):20－23.

［14］ Hirai H，Nakanishi S，Nishida T.Oxidative dechlorination of methoxychlor by ligninolytic enzymes from white-rot fungi［J］.Chemosphere，2004，55:641 －645.

［15］ Maruyama T，Komatsu C，Michizoe J，et al.Laccasemediated degradation and reduction of toxicity of the postharvest fungicide imazalil［J］.Process Biochem，2007，42(3):459－461.

［16］ Raquel O，Crist v o.Kinetic modelling and simulation of laccase catalyzed degradation of reactive textile dyes［J］.Bioresour Technol，2008，99(11):4768 －4774.

［17］ 尹亮，陈章和，赵树进.白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色［J］.华南理工大学学报(自然科学版)，2008，36(12):85－90.

［18］ 何为，詹怀宇，王习文，等.一种改进的漆酶酶活检测方法［J］.华南理工大学学报(自然科学版)，2003，31(12):46－50.

［19］ 张鹏.以ABTS为底物测定漆酶活力的方法［J］.印染助剂，2007，24(1):43－45.

［20］ Coll P M，Fernandez-Abalos J M，Villanieva J R，et al.Purification and characterization of a phenoloxidase laccase from the lignin-degrading basidiomycete PM1(CECT2971)［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59(18):2607－2613.

Cultivation Condition Optimization for Laccase Production from Coriolus Versicolor and Degradation of Basic Violet 5BN

Yin Jianglai，Ma Ying，Jia Honghua，Zhou Hua，Wei Ping

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing Jiangsu 210009，China)

The fermentation conditions for laccase production from Coriolus Versicolor were optimized by experiments.The optimum fermentation conditions are as follows:Using sodium carboxymethy cellulose with 15 g/L of mass concentration and glucose with 1.25 g/L of mass concentration as the complex carbon source;using yeast extract with 15 g/L of mass concentration as the nitrogen source;adding 2，5-dimethylaniline with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 72 h;adding Cu2+with 2 mmol/L of concentration at the fermentation time for 96 h.When the fermentation time is 168 h，the enzyme activity can reach 3 319.2 U/mL.The solution containing basic violet 5BN was treated using the laccase produced by this strain.When the enzyme activity of the crude enzyme solution is 0.01 U/mL and the treatment time is 10 h，the decolorization rate is 93.91%.

Coriolus Versicolor;laccase;fermentation;basic violet 5BN;decolorization

X791

A

1006－1878(2011)04－0293－05

2011－01－12;

2011－03－03。

尹将来(1986—)，男，江苏省宜兴市人，硕士生，主要研究方向为生物化工。电话 13813366217，电邮leoy_yin@163.com。联系人:周华，电话 025 －83172079，电邮 zhouhua@njut.edu.cn。

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2009CB724706);国家自然科学基金资助项目(20906048)。

(编辑 王 馨)