高效液相色谱法测定利夫康洗液中蛇床子素的含量*
2011-12-08李鹏陈琴华朱军彭林
李鹏,陈琴华,朱军,彭林
(湖北医药学院附属东风医院药剂部,湖北十堰 442008)
利夫康洗液由苦参、黄柏、蛇床子、白鲜皮、黄连、地肤子、花椒、赤芍、板蓝根、何首乌、土茯苓等11味中药组成,具有清热燥湿、杀虫止痒功效,常用于真菌性、滴虫性阴道炎以及湿疹、接触性皮炎和体股癣。蛇床子素是蛇床子中主要有效成分之一,现代药理实验研究证明其具有抗滴虫作用和性激素样等作用[1-4]。为了控制该洗液质量,笔者对利夫康洗液中的蛇床子素进行含量测定,为利夫康洗液质量评价提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Ultimate3000高效液相色谱仪包括Ultimate3000泵,Ultimate3000二极管阵列检测器,四元低压混合系统,Chromeleon工作站;KQ-100DB型数控超声波清洗器;HP-01溶剂过滤器;日本岛津AEU-210电子天平;TG16G离心仪。
1.2 试药 蛇床子素(中国药品生物制品检定所,批号:110822-20040);甲醇为色谱纯,水为双蒸水,其余溶剂均为分析纯;利夫康洗液(西安太极药业有限公司,批号:090102,091105,091005)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性条件 色谱柱:日本DLCl8柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(65∶35);检测波长为322 nm;柱温:30℃;流速:1.0 mL·min-1。理论塔板数按蛇床子素计算应不低于2 000,主峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2.2 溶液的制备 对照品溶液的制备:精密称取蛇床子素对照品10.0 mg置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,得贮备液,精密吸取贮备液1 mL至10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,制成含蛇床子素为100μg·mL-1的对照品溶液。
供试品溶液的制备:精密吸取利夫康洗液30 mL,水浴锅中(95℃)挥干,加入30 mL乙醚溶解,过滤,滤液挥干,加入甲醇5 mL,完全溶解,过孔径0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
阴性对照溶液的制备:取按照利夫康洗液的制备工艺配制独缺蛇床子的阴性样品30 mL,照供试品溶液制备方法,制成阴性对照溶液。
2.3 专属性考察 按“2.1”项下色谱条件,精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪,供试品溶液色谱图上在与对照品溶液相应的位置上有一相同的色谱峰。而阴性对照品溶液在此保留时间无吸收峰,表明阴性对照品对测定无干扰。色谱图见图1。
图1 3种溶液的高效液相色谱图1.阴性对照品溶液;B.对照品溶液;C.样品溶液;1.蛇床子素Fig.1 HPLC Chromatogram s of 3 kinds of solutionA.negative control;B.reference substance;C.sample;1.osthole
2.4 线性关系和最低检测限 精密吸取蛇床子素对照品溶液,加甲醇使溶解,稀释至刻度,使其浓度分别为 2,10,20,50,80,100 μg·mL-1;精密吸取上述溶液各10μL注入高效液相色谱仪,以溶液浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归,得回归方程为:Y=0.520 5X-0.045 4,r=0.999 5。由上可知,在 2~100 μg·mL-1范围内,蛇床子素浓度与峰面积线性关系良好。在信噪比(S/N)为3时,测得最低检出限为0.05μg·mL-1,相对标准偏差(RSD)为3.75%。
2.5 精密度、重复性和稳定性实验 精密度实验:取供试品溶液,连续进样6次,记录峰面积,计算蛇床子素峰面积的RSD为1.52%。
重复性实验:取同一批样品6份,按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备,进样分析,记录峰面积,计算蛇床子素峰面积的RSD为1.63%。
稳定性实验:精密吸取同一供试品溶液,于室温放置12 h,分别在0,2,4,8,12 h 进样测定,记录峰面积,计算蛇床子素峰面积的RSD为2.01%。表明处理后所得供试品溶液在12 h内稳定。
2.6 加样回收率 取同一供试品(9.70μg·mL-1)6份,分别加入蛇床子素对照品(100μg·mL-1)1.0,2.0,5.0 mL,各2份,按“2.2项”下供试品溶液制备方法制备,并按“2.1”项下色谱条件进样10μL测定,结果蛇床子素平均回收率99.7%,RSD为1.12%,见表1。
表1 蛇床子素加样回收率实验结果Tab.1 The recovery of osthole μg
2.7 样品的测定 取本品3批(批号分别为090102,091105,091005)适量,按“2.2”项下供试品溶液制备方法制备3份,精密吸取10μL注入高效液相色谱仪,记录峰面积,由外标法计算蛇床子素含量分别为9.70,10.25和8.68μg·mL-1,即利夫康洗液中蛇床子素平均含量为9.54μg·mL-1。
3 讨论
本实验曾考察了几种不同的流动相系统[5-6],最后确定用甲醇-水(65∶35)作为流动相,较乙腈简单且经济,蛇床子素与其他成分能达到基线分离,且理论塔板数高,所建立利夫康洗液中的蛇床子素的高效液相色谱含量测定方法专属性强,精密度好,回收率高,适合用于其质量评价。
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