怡心健脑软胶囊的质量控制*

章曙丹，姜建民，杨明华，聂磊

(1.山东大学药学院药物分析研究所，济南 250012;2.浙江省中药研究所中成药研究室，杭州 310023)

怡心健脑软胶囊是新型中药复方制剂，由五味子、续断、川芎、石菖蒲、益智、黄芪、柏子仁等多味中药组成，具有补气安神、益智健脑的功效。为有效控制该制剂的质量，笔者对川芎、石菖蒲、益智、五味子、黄芪、续断进行薄层色谱(thin-layer chromatography，TLC)鉴别，并采用高效液相色谱(HPLC)法测定五味子醇甲和川续断皂苷Ⅵ的含量，为该制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪，VWD检测器;PerkinElmer Lamda 20 UV/VIS分光光度仪;Dikma C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，AB204-S电子分析天平(METTLER TOLED公司);KQ-3200B型超声波清洗器。

1.2 试药 乙腈(TEDIA公司，色谱纯)，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。怡心健脑软胶囊样品4批(批号:20090704，20091204，20091205，20091206)均为本所制剂室自制，规格:每瓶25 g。

1.3 对照品及对照药材 五味子醇甲对照品(批号:110857-200406，供含量测定用)，川续断皂苷Ⅵ对照品(批号:111685-200401，供含量测定用)，黄芪甲苷对照品(批号:110781-200512)，五味子对照药材(批号:120922-200606)，川芎对照药材(批号:120918-200608)，石菖蒲对照药材(批号:121098-200403)，续断对照药材(批号:121033-200608)，益智对照药材(批号:121029-200503)，五味子甲素(批号:764-9201)，五味子乙素(批号:765-9202)均购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 川芎、石菖蒲的TLC鉴别 取本品(批号:20090704，下同)1 g，置试管中，加乙酸乙酯5mL，超声提取20 min，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取川芎对照药材和石菖蒲对照药材各1 g，同法制成对照药材溶液。按照TLC法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)(下同)实验，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷—乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰，见图1。

图1 川芎和石菖蒲TLC色谱图1.缺川芎阴性样品;2.川芎对照药材;3～4，9～10.样品(甲醇提取);5～6.样品(乙酸乙酯提取);7.缺石菖蒲阴性样品;8.石菖蒲对照药材Fig．1 TLC of rhizoma chuanxiong and rhizoma acori tatarinow ii1.negative control without rhizoma chuanxiong;2.rhizoma chuanxiong standard;3-4，9-10.test samples(extracted by methanol);5-6.samples(extracted by ethyl acetate);7.negative control without rhizoma acori tatarinowii;8.rhizoma acori tatarinowii standard

2.1.2 黄芪和续断的TLC鉴别 供试品溶液制备:取本品1.0 g，精密称定，置蒸发皿中，加水20 mL溶解并转移至分液漏斗中，加水饱和乙醚萃取2次，每次20 mL，弃去萃取液，水层用水饱和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并萃取液，加氨试液清洗2次，每次40 mL，正丁醇液再用水清洗2次，每次40 mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，用孔径0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。另取黄芪甲苷对照品和川续断皂苷Ⅵ对照品，分别加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取续断对照药材，照《中华人民共和国药典》续断项下的TLC鉴别方法制备对照药材溶液。吸取上述供试品溶液10，30μL、对照品溶液2μL、对照药材溶液5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，紫外光灯(365 nm)下显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰，见图2。

图2 黄芪和续断TLC色谱图1.缺黄芪阴性样品;2.黄芪甲苷对照品;3～4.样品30μL;5.缺续断阴性样品;6.川续断皂苷Ⅵ对照品;7.续断对照药材;8～9.样品10μLFig．2 TLC of radix astragali and radix dipsaci1.negative control without radix astragali;2.astragalosideⅣstandard;3-4.test samples;5.negative control without radix dipsaci;6.asperosaponinⅥstandard;7.radix dipsaci standard;8-9.tenμL samples

2.1.3 益智的TLC鉴别 取样品挥发油0.4 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取益智对照药材，照《中华人民共和国药典》益智项下的TLC鉴别方法制备对照药材溶液。吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(8∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，紫外光灯(365 nm)下显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰，见图3。

2.1.4 五味子的TLC鉴别 取本品1 g，加甲醇5 mL，超声提取20 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取五味子甲素、五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取五味子对照药材，照《中华人民共和国药典》2010年版五味子项下的TLC鉴别方法制备对照药材溶液。吸取上述供试品溶液10μL、对照品和对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶 GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶7∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，紫外光灯(波长254 nm)下显相同颜色的荧光萃灭斑点。阴性对照无干扰，见图4。

图3 益智TLC鉴别色谱图1.缺益智阴性样品;2.益智对照药材;3～4.样品Fig．3 TLC of fructus alpiniae oxyphyllae1.negative control without fructus alpiniae oxyphyllae;2.fructus alpiniae oxyphyllae standard;3-4.samples

图4 五味子TLC色谱图1.缺五味子的阴性样品;2.五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品;3～4.样品;5.五味子对照药材Fig．4 TLC of fructus schisandrae chinensis1.negative control without fructus schisandrae chinensis;2.standard of schizandrin， deoxyshisandrin and γ-schisandrin(upwards);3-4.samples;5.fructus schisandrae chinensis standard

2.2 含量测定

2.2.1 五味子醇甲的含量测定

2.2.1.1 测定波长的确定 取五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解，稀释至一定刻度，置紫外/可见分光光度仪中，在190～400 nm之间扫描，绘制紫外吸收光谱。结果表明五味子醇甲在250 nm处有最大吸收。因此，测定波长定为250 nm。

2.2.1.2 色谱条件与系统适应性 色谱柱:Dikma C18柱(250mm×4.6mm，5μm);流动相:乙腈∶水，梯度洗脱0 ～14 min，乙腈45%;～22min，乙腈65%;～30 min，乙腈45%。流速:1 mL·min-1;检测波长:250 nm;柱温:25℃;进样量:对照品溶液5μL，、供试品溶液20μL。保留时间:约为13 min。色谱图见图5。

图5 五味子醇甲阴性对照品、对照品和供试品的HPLC色谱图A.阴性对照品;B.对照品;C.供试品;1.五味子醇甲Fig．5 HPLC chrom atogram of schisandrin negative reference substance，reference substance and sam pleA.negative reference substance;B.reference substance;C.sample;1.schizandrin

2.2.1.3 对照品溶液制备 精密称取真空干燥至恒质量的五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升含160μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.1.4 供试品溶液制备 取本品(批号:20090704，下同)0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定，超声提取30 min，取出，放冷，用甲醇补足损失的质量。摇匀，用孔径0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.5 检测限及最小检出量的测定 取对照品溶液:五味子醇甲0.16 mg·mL-1稀释25倍。进样，测定，检测限为3.20 ng;最低定量限为16.00 ng。

2.2.1.6 提取方法比较 取本品0.8 g，精密称定，精密加入甲醇30 mL，称定，分别采用超声波提取法和回流法提取30 min，取出，放冷，用甲醇补足损失的质量。摇匀，用孔径0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液进样，测得超声法和回流法提取的五味子醇甲含量分别为1.60和1.57 mg·g-1。结果表明超声提取法较好。

2.2.1.7 提取时间比较 取本品0.8 g，精密称定，精密加入甲醇30 mL，称定，分别超声提取20，30，40 min，取出，放冷，用甲醇补足损失的质量。摇匀，用孔径0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液进样，测得五味子醇甲含量分别为1.53，1.57，1.57 mg·g-1。结果表明超声30 min可提取完全。

2.2.1.8 线性范围考察 精密称取五味子醇甲适量，加甲醇溶解并分别制成 0.008，0.016，0.032，0.064，0.096，0.128，0.160 mg·mL-1的对照品溶液，按上述色谱条件进样10μL，测定峰面积，以进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，求得回归方程为 Y=1 322.770 0X-5.282 2，r=0.999 96，结果表明五味子醇甲在0.080～1.600μg之间呈良好的线性关系。

2.2.1.9 精密度实验 取同一对照品溶液重复进样测定5次，测得五味子醇甲峰面积分别为845.5，864.5，865.0，850.3，852.5，平均峰面积为 855.6，RSD=1.02%。

2.2.1.10 稳定性实验 取本品供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，24 h 进行测定，结果测得五味子醇甲含量分别为 1.56，1.58，1.60，1.60，1.62，1.62 mg·g-1，平均含量为1.60 mg·g-1，RSD=1.40%。说明供品溶液在24 h内稳定。

2.2.1.11 重复性实验 取本品6份，精密称定，按供试品液制备方法处理，按上述色谱条件测定。结果五味子醇甲平均含量1.58 mg·g-1，RSD=0.51%(n=6)。

2.2.1.12 加样回收率实验 精密称取已知含量的本品0.4 g，共6份，分别加入五味子醇甲对照品溶液(浓度为0.65 mg·mL-1)1 mL，再精密加入甲醇29 mL，按上述方法制成供试品溶液，依法进行测定，计算回收率，结果五味子醇甲平均加样回收率99.56%，RSD 0.82%，见表1。

表1 五味子醇甲加样回收率实验结果Tab．1 Results of recovery of schisandrin n=6

2.2.2 川续断皂苷Ⅵ的含量测定

2.2.2.1 测定波长的确定 取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，加甲醇溶解，稀释至一定刻度，置紫外/可见分光光度仪中，在190～400 nm之间扫描，绘制紫外吸收光谱。结果表明川续断皂苷Ⅵ在212 nm处有最大吸收。因此，测定波长定为212 nm。

2.2.2.2 色谱条件与系统适应性 色谱柱:Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，迪马公司);流动相:乙腈:水，梯度洗脱:0～13 min，乙腈28%;～20 min，乙腈40%;～30min，乙腈28%。流速:1mL·min-1;检测波长:212 nm;柱温:25℃;进样量:对照品溶液5μL、供试品溶液10μL。保留时间约13 min。色谱图见图6。

2.2.2.3 对照品溶液制备 精密称取真空干燥至恒质量的川续断皂苷Ⅵ对照品适量，加甲醇溶解，制成每毫升含920μg的溶液，作为对照品溶液。

图6 川续断皂苷Ⅵ对照品、供试品和阴性对照品的HPLC色谱图A.阴性对照品;B.对照品;C.供试品;1.川续断皂苷ⅥFig．6 HPLC chromatogram of asperosaponin Ⅵ，sam p le and negtive controlA.negative control;B.reference substance;C.sample;1.asperosaponinⅥ

2.2.2.4 供试品溶液制备 同“2.1.2”。

2.2.2.5 检测限及最小检出量的测定 取对照品溶液:川续断皂苷Ⅵ0.92 mg·mL-1稀释50倍。进样，测定，检测限为0.092 ng;最低定量限为0.460 ng。

2.2.2.6 提取方法比较 取本品1.0 g，精密称定，分别比较了①正丁醇回流提取，提取液合并，水洗4次;②样品正丁醇回流提取后，水洗4次，上聚酰胺柱;③样品水溶解后正丁醇萃取，水洗4次;④样品水溶解后正丁醇萃取，氨试液清洗，水洗等方法。结果前面3种方法制备的样品溶液在定容时均有较厚油脂层，导致无法精确定容。而用最后一种方法制备的供试液不存在此问题，显示氨试液对本品的清洗效果优良。

2.2.2.7 提取次数比较 对本品正丁醇萃取次数进行了比较，分别萃取3，4，5次，测得川续断皂苷Ⅵ含量分别为1.90，1.97，1.98 mg·g-1。表明萃取 4 次即可提取完全。

2.2.2.8 线性范围考察 精密称取川续断皂苷Ⅵ适量，加甲醇溶解并分别制成 0.092，0.184，0.368，0.552，0.736，0.920，1.104 mg·mL-1的对照品溶液，进样10μL，测定峰面积，以进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，求得回归方程为Y=104.82X-1.090 5，相关系数 r=0.999 9，结果表明川续断皂苷Ⅵ在0.92～11.04μg之间呈良好的线性关系。

2.2.2.9 精密度实验 取同一对照品溶液重复进样测定5次，进样量10μL，测得川续断皂苷Ⅵ峰面积分别为576.2，577.1，578.2，577.1，576.5，平均峰面积为577.0，RSD=0.13%。

2.2.2.10 稳定性实验 取本品1.0 g，精密称定，按上述方法制成供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12，24 h 进行测定，结果测得川续断皂苷Ⅵ含量分别为2.00，2.05，2.03，2.03，2.05，2.08 mg· g-1，平 均 含 量 为2.04 mg·g-1，RSD=1.32%。说明供品溶液在24 h内稳定。

2.2.2.11 重复性实验 取本品6份，精密称定，按供试品液制备方法处理，进样量为10μL，按上述色谱条件测定。结果川续断皂苷Ⅵ的平均含量为2.04 mg·g-1，RSD=1.80%(n=6)。

2.2.2.12 加样回收率实验 精密称取已知含量的本品0.5 g，取6份，分别加入川续断皂苷Ⅵ对照品溶液(浓度1.089mg·mL-1)1mL，挥去甲醇，按上述方法制成供试品溶液，依法进行测定，计算回收率，结果川续断皂苷Ⅵ平均加样回收率99.49%，RSD2.69%，见表2。

表2 川续断皂苷Ⅵ加样回收率实验结果Tab．2 Results of recovery of asperosaponin Ⅵ

2.2.3 挥发油测定 取本品100 g，置圆底烧瓶中，加水250 mL，照挥发油测定法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录Ⅹ D)实验，提取挥发油。结果3批样品的挥发油含量分别为(V/W)0.92%，0.86%，0.82%。

2.2.4 样品测定 取样品3批(批号:20091204，20091205，20091206)，按供试品溶液制备方法制备供试液，依上述色谱条件测定并计算供试品中五味子醇甲和川续断皂苷Ⅵ的含量。结果3批样品中五味子醇甲的含量依次为 1.66，1.63，1.67 mg·g-1，RSD 值依次为0.15%，0.24%，0.59%(n=3)。样品中川续断皂苷Ⅵ的含量依次为 1.81，1.88，1.95 mg·g-1，RSD值依次为0.42%，0.53%，0.45%(n=3)。

3 讨论

3.1 流动相选择 本文两个含量测定指标均采用梯度洗脱以提高分析效率。五味子醇甲的分离先后试用过不同比例的甲醇-水［1-3］、甲醇-乙腈-水［4-6］等多种溶剂系统，分离效果均不满意，经摸索后采用乙腈-水梯度洗脱系统分离效果明显改善。

3.2 含量测定指标的选择 根据工艺特点，分别选用脂溶性部分的五味子醇甲和水提部分的川续断皂苷Ⅵ为含量测定项目。另外，对方中所有潜在的含测指标均进行了研究:如:黄芪甲苷和川芎中的阿魏酸等，含量均太低;五味子甲素和五味子乙素的色谱峰保留时间长，峰形不佳，含量也很低，故未将它们列入标准。

3.3 川芎与石菖蒲、黄芪与续断的薄层鉴别 分别采用同一展开系统，特征斑点分离良好。上述4味药材的鉴别尤其在低湿度条件下斑点更为圆整。由于样品油脂较多，黄芪与续断的薄层鉴别经氨试液清洗除杂［7-9］，能减轻谱带底色，消除斑点拖尾，同时配合较长展距达到较好分离。方中益智的鉴别曾采用《中华人民共和国药典》(2010年版)的显色方法，虽尝试不同展开剂，但都存在特征斑点与阴性样品中五味子乙素的斑点相互干扰的问题，采用10%硫酸乙醇为显色剂，加热至显色清晰后置365 nm下检视，绿色荧光斑点清晰灵敏，专属性强。而五味子的鉴别则采用五味子醇甲和甲素为指标，并将五味子甲素展开系统的比例进行了调整，以提高五味子醇甲的Rf值，从而同时鉴别两个指标。

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