肉孢子虫免疫学及相关研究进展

马碧书，苏绍祥，杨照青

（1.昆明医学院海源学院微生物学暨免疫学教研室，云南昆明650106；2.昆明医学院海源学院病原实验室，云南昆明650106；3.昆明医学院寄生虫学教研室，云南昆明650031）

肉孢子虫免疫学及相关研究进展

马碧书1，3，苏绍祥2，杨照青3*

（1.昆明医学院海源学院微生物学暨免疫学教研室，云南昆明650106；2.昆明医学院海源学院病原实验室，云南昆明650106；3.昆明医学院寄生虫学教研室，云南昆明650031）

肉孢子虫作为一种抗原性物质进入宿主体内，能刺激机体发生特异性免疫应答。研究肉孢子虫抗原结构及其与宿主相互关系可为肉孢子虫病的诊断、预防和治疗提供可靠依据。本文综述了近年来国内外学者对肉孢子虫免疫学及相关课题的研究进展。

肉孢子虫，免疫学，

肉孢子虫（Sarcocystis）属于顶复门（Apicomplex），孢子虫纲（Sporozoa），真球虫目（Eucoccidia），肉孢子虫科（Sarcocystidae），种类较多，广泛寄生于两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等，引起人畜共患肉孢子虫病（sarcocystosis）。该病流行广泛，感染率高，对人畜危害较大。

开展肉孢子虫免疫学研究，探讨其与宿主之间的相互关系不仅为疾病的诊断、疗效判定等提供检测手段，同时还为疫苗研制提供可靠依据。近年来，肉孢子虫的免疫学研究取得了很大进展，本文就此作一综述。

1 血清抗体检测

1.1 用于流行病学调查

应用特异性血清抗体检测的方法可以大量地、广泛地进行流行病学调查，从而了解肉孢子虫病的流行情况，更好地控制疾病的传播。Mitchell等［1］以福尔马林固定的裂殖子作为抗原检测康涅狄格州臭鼬、浣熊、负鼠的神经肉孢子虫（Sarcocystis neurona）凝集素抗体，感染率分别为臭鼬46%（11／24），浣熊100%（10／10），负鼠0（0／7）；Lindsay DS等用同样的方法检测99只浣熊的神经肉孢子虫凝集素抗体，44%（44／99）的浣熊神经肉孢子虫抗体阳性，效价大于或等于1：500，这个结果和用western blot法测定的美国马的神经肉孢子虫抗体阳性率33%～60%的报道相似。

Vardelieon D等用免疫斑点试验检测美国5个不同地方（根据弗吉尼亚负鼠属分布抽样）马的神经肉孢子虫抗体，共检查了208份血清样本，神经肉孢子虫抗体阳性率从0（新泽西和蒙大拿）到54%（密苏里）不等；Tanhauser SM等应用Western blot技术检测野外捕捉的19只和驯养的17只九带犰狳，前者神经肉孢子虫抗体均为阳性，后者只有1只阳性，说明九带犰狳对神经肉孢子虫的自然感染率高。Valadas S等人［2］使用血清学诊断方法，对除神经肉孢子虫外的多个虫种进行了流行病学调查。

1.2 发现肉孢子虫新宿主

对肉孢子虫病流行区不同动物体内相应抗体进行检测可以发现肉孢子虫新宿主，有利于研究肉孢子虫对不同动物的感染情况，从而更好地控制感染。

Gillis KD等［3］用血清学方法检测了100只猫的神经肉孢子虫抗体并同时对其中的50只猫进行肌肉切片法检查，在5（10%）只猫的肌肉中找到肉孢子虫包囊，经形态学、分子生物学确认为猫肉孢子虫（S.felis）；同时，抗神经肉孢子虫抗体阳性率为5%（5／100），但在肌肉中未找到神经肉孢子虫。据此，他认为猫有感染神经肉孢子虫的可能。此后，一些学者对猫体内神经肉孢子虫感染情况进行了相关研究，并报道了猫感染神经肉孢子虫相关性脑炎的病例。因此，猫被认为是神经肉孢子虫生活史中的自然中间宿主。

最新的报道来自Hsu V等［4］对弗吉尼亚和宾夕法尼亚州猫体内的神经肉孢子虫抗体的检测。他们取441只猫（弗吉尼亚232只，宾夕法尼亚209只）血清，作1：50稀释，采用间接荧光抗体试验（indirect fluorescent antibody test，IFAT）检测神经肉孢子虫裂殖子抗体。结果32只猫（7%，32／441）检测到特异性IgG抗体，其中22只来自弗吉尼亚，阳性率9%（22／232）；10只来自宾夕法尼亚，阳性率5%（10／209）。

1.3 辅助诊断肉孢子虫病

肉孢子虫寄生于中间宿主的肌肉组织中，病原学诊断取材不易，且耗时耗力；在终宿主体内，卵囊或孢子囊虽可随粪便排出体外，但因其体积微小，无色透明，容易漏诊。免疫学诊断技术可作为辅助手段弥补这方面的不足。

早在上世纪70年代，人们就开始了肉孢子虫血清学诊断的研究［5～6］，得出以下重要结论：①口服肉孢子虫抗原能刺激机体产生相应抗体，但是冰冻或加热肉孢子虫抗原会降低其免疫原性；②肉孢子虫抗体能通过免疫学方法检测到，较为可靠的方法是IFAT；③肉孢子虫抗体在中间宿主和终宿主体内均能检测到；④肉孢子虫抗原与弓形虫病患者血清无交叉反应，这一点已在弓形虫病患者及弓形虫实验感染小鼠血清中得到证实。

肉孢子虫血清抗体检测常用于肉孢子虫病的辅助诊断，据此发现了不少肉孢子虫感染病例。如在341例弓形虫疑似病例中检测到22.5%～44.4%的病人血清肉孢子虫抗体阳性，但此种病例至今报告较少，分布不均。一支由15人组成的美国军队在马来西亚农村执行任务时，有7人出现发热、肌痛、支气管痉挛、嗜酸性皮下结节等急性症状，对其中的8人进行肉孢子虫抗体检测，6人阳性，且4例有嗜酸性肌炎者均为阳性。据此，Arness MK等认为这次嗜酸性肌炎的暴发是由肉孢子虫感染引起的。

为了检测马神经肉孢子虫感染后血清抗体含量及特异性抗体效价的变化，Heskett KA等［7］用18匹成年马进行了研究。14匹马作为试验组，感染神经肉孢子虫孢子囊（因有其他的研究目的，一些实验组马匹断断续续接受了ponazuril治疗，剂量20 mg／kg，PO）；4匹作对照。在感染第1天和第84天收集脑脊液和血液标本，以裂殖子可溶性抗原作为诊断试剂，采用ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）直接法检测神经肉孢子虫特异性IgG，分别报告SN（CSF）和SN（plasma）。用夹心ELISA和IFA法（immunofluorescence assay）分别检测脑脊液中的IgG总量（IgG，CSF）和血清中的IgG总量（IgG，plasma），计算Q（SN），Q（IgG）和AI（antibody index）。结果显示，试验组SN（CSF）和SN（plasma）显著升高，而总抗体含量无明显变化。这提示我们特异性抗体含量可以用于马的神经肉孢子虫相关脑脊髓炎的辅助诊断。Witonsky［8］的研究也得出了相似的结果。

1.4 用于家畜屠宰前的检疫

本世纪初，我国学者周望平［9］等已报道用快速ELISA法诊断家畜住肉孢子虫病，并将该法推广应用于家畜屠宰前的检疫。他们采用梭形住肉孢子虫（S.fusiformis）、枯氏住肉孢子虫（S.cruzi）制备可溶性抗原，研制出住肉孢子虫病快速ELISA诊断试剂盒，用作猪、牛、羊住肉孢子虫病的快速诊断。并用该试剂盒检测了湖南省洞庭湖地区具有代表性的华容县、沅江市屠宰水牛、猪的住肉孢子虫感染情况，证明该试剂盒具有快速、准确、敏感性高等特点。该法操作过程不需任何特殊仪器，30 min即可获得结果，具有很强的敏感性和实用性。研究还发现，应用此EIISA诊断试剂盒的显色反应与动物住肉孢子虫感染强度呈正相关，即动物感染强度越高，显色越深，反之，显色越淡，据此可判断家畜感染程度。Moré［10］等人也将此法应用于农场牛感染肉孢子虫的检查。

2 免疫组织化学技术对肉孢子虫感染进行定位

随着抗原的提纯以及抗体标记技术的改进，尤其是单克隆抗体技术和原位杂交技术的引入，免疫细胞化学在生物基础研究中日益显示出巨大的实用价值。免疫组织化学技术（immunohistochemistry）就是一个很好的例子，把免疫反应的特异性和组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用进行检测。用标记的肉孢子虫特异性抗体可以对组织内肉孢子虫的分布进行细胞和组织定位。

Dubey JP［11］等在野外捕捉的负鼠肠道中找到肉孢子虫孢子囊（感染率为54.5%，24／44），孢子囊数低的少于1万，高的超过2亿，并将24只阳性负鼠来源的孢子囊喂给γ－干扰素基因敲除小鼠或裸鼠，其中14只负鼠来源的孢子囊对小鼠具有感染性。通过神经肉孢子虫抗体特异性染色，在小鼠组织找到了神经肉孢子虫。应用同样的方法，在密西西比河流域的农村，从19只负鼠肠道取来的孢子囊感染的小鼠脑部发现了神经肉孢子虫。Burcham等［12］通过免疫组化方法对有神经症状的臭鼬（striped skunk，Mephitismephitis）进行研究表明，免疫抑制是所研究的臭鼬患神经肉孢子虫感染的重要因素。Wünschmann等［13］通过免疫组化方法和基因研究手段对S.falcatula自然感染鹰的研究进行了报道。Britton等［14］对雪貂（ferret，Mustela putorius furo）感染肉孢子虫的研究也使用了类似的方法。

3 分析研究肉孢子虫抗原，促进血清学诊断技术的发展

对肉孢子虫抗原成分进行系统分析，探讨这些抗原与肉孢子虫的相互关系是免疫学研究的关键。神经肉孢子虫在美国作为马原虫性脑脊髓炎（equine protozoalmyeloencephalitis，EPM）的主要病原体而被广泛熟知，其裂殖子表面抗原（surface antigens of S.neurona，SnSAGs）是疾病的主要原因。这些表面抗原为免疫显性抗原，因此是EPM诊断和疫苗研制的重要备选成分。

3.1 肉孢子虫病血清学诊断技术面临挑战

长期以来，人们主要通过对马血清或脑脊液中SAG－1抗体进行检测来诊断EPM。近日，Johnson AL等［15］用ELISA法、IFAT两种方法对EPM自然感染病例进行临死前诊断。结果发现，ELISA法检测血清标本SAG－1敏感性为12.5%（95%CI，1.6～38.4），特异性为97.1%（95%CI，84.7～99.9）；IFAT法检测，血清标本敏感性为94.4%（95%CI，72.7～99.9），特异性为85.2%（95%CI，66.3～95.8）；脑脊液标本敏感性为92.3%（95%CI，64.0～99.8），特异性为89.7%（95%CI，72.7～97.8）。据此认为SAG－1 ELISA检测的低敏感性限制了它在诊断EPM的应用，而IFAT检测法也不是最佳的方法。研究肉孢子虫相关抗原，寻找一种特异性更高，敏感性更强的抗原成为肉孢子虫病血清学诊断的迫切需要。

3.2 神经肉孢子虫表面抗原多态性研究

已有研究证实，有些EPM感染的病原体主要表面抗原SnSAG1表达缺失［16—17］，这就提示我们不同的神经肉孢子虫表达的SnSAGs存在差异。因此，科学家们开展了大量的生物信息学、分子生物学、免疫学的相关研究，试图在众多SnSAGs中找到特异性强，且具有保护作用的抗原成分。从EST（expressed sequence tag）库获悉，SnSAGs具有显著的多态性，且EPM的病原SN4株缺乏主要的表面抗原SnSAG1，这一事实已经通过Western blot和Southern blot证实。

为了研究神经肉孢子虫SnSAGs存在多态性，Howe DK等［16］采用Western blots法，用4种SnSAGs特异性抗体检测了14株神经肉孢子虫。结果显示，14株神经肉孢子虫均表达SnSAG2，SnSAG3和SnSAG4，但SnSAG4的表达在不同株之间存在差异；更为重要的是，7株神经肉孢子虫不表达SnSAG1，其中4例从EPM感染的马分离出来，1例从患致死性脑膜脑炎的海獭体内分离出来。采用PCR进行遗传学分析，发现SnSAG1表达缺失的7株神经肉孢子虫中有6株具有相同的基因序列。总之，不同分离株的神经肉孢子虫表面抗原的表达存在异质性，这就提示我们，在研究EPM血清学诊断以及疫苗研制的过程中对于抗原分子的选取有待进一步研究；同时，这种不均一性是否与肉孢子虫的其他表型（如毒力等）以及肉孢子虫有性生殖阶段的发育等有关仍需进一步探讨。

3.3 发现神经肉孢子虫新的表面抗原SnSAG5

神经肉孢子虫不同株之间SnSAGs存在多样性，包括主要表面抗原SnSAG1的缺失。然而，Crowdus CA等［17］在2个SnSAG1缺失的虫株发现了新的抗原，并对此抗原进行了研究和报道，将其命名为SnSAG5。SnSAG5本质上是一种与其他SAGs并存的表面分子，表达于神经肉孢子虫及其他相关的肉孢子虫表面。Crowdus CA等收集了13株神经肉孢子虫，用Western blot方法进行检测，证实其中6株的SnSAG5取代了SnSAG1的表达，且SnSAG5不表达于SnSAG1阳性的虫株。同时还发现了1株从海獭脑部分离出来的肉孢子虫既不表达SnSAG1，也不表达SnSAG5。对SnSAG5特异性基因序列进行分析，发现SnSAG5阳性虫株表达相应基因，并且该基因还表达于SnSAG1缺失、SnSAG5缺失的海獭分离株。这一发现推进了神经肉孢子虫多样性的研究，为EPM诊断方法的研究以及疫苗的研制提供了更充足的依据，同时，也促进了对肉孢子虫在终宿主负鼠体内的生活史循环的群体生物学研究。

4 重组肉孢子虫表面抗原应用研究

近年来，随着分子生物学的迅速发展，许多生物技术引入到寄生虫学的研究中。运用分子克隆等技术可以获得大量纯化的重组寄生虫抗原，使一些来源困难的抗原在分子水平上得到深入研究，为寄生虫诊断抗原的制备以及疫苗的研制提供了新的途径。先前的研究已经发现了编码神经肉孢子虫表面抗原SnSAGs的基因群，这些表面抗原对宿主具有免疫原性，因此被认为是诊断和疫苗研制的候选分子。

Hoane JS等［18］应用ELISA法以rSnSAGs检测马血清中的相应抗体。他们采集了36份马血清，这些马血清已经当前的金标准Western blot法证实检测到神经肉孢子虫抗体。通过ELISA发现，rSnSAG2敏感性和特异性最高，分别为95.5%和92.9%，而rSnSAG1最低，分别为68.2%和71.4%。这也说明，rSnSAG1用于马神经肉孢子虫感染的血清学诊断是不可靠的，应该选择其他敏感性和特异性更高的抗原取代rSnSAG1。同时还发现，这些抗原与马的另外两种寄生虫——法氏肉孢子虫（Sarcocystis fayeri）和赫氏新孢虫（Neospora hughes）无交叉反应。rSnSAG ELISAs与神经肉孢子虫抗体结合的精确性和可靠性表明，肉孢子虫免疫学研究进入了重组抗原时代，这种重组肉孢子虫抗原将有望用于相关疾病的诊断及疫苗的研制。

最近，我们看到Yeargan等人［19］对神经肉孢子虫ELISA试剂盒进行的改进研究报道。将现有的基于肉孢子虫表面抗原SnSAG2、SnSAG3和SnSAG4的ELISA诊断试剂盒进行了改良，制成了重组多价肉孢子虫抗原的试剂盒，从而避免了因肉孢子虫表面抗原多样性及可变性带来的诊断困难，提高了血清学诊断的可靠性。疫苗研制方面，Ellison等［20］用重组的神经肉孢子虫表面抗原1（recombinant surface antigens of S.neurona，rSnSAG1）制成的疫苗免疫马，产生了相应抗体，该抗体不仅对体外培养的裂殖子具有中和作用，而且能明显减轻肉孢子虫感染的临床症状。

5 结语

近年来，肉孢子虫免疫学研究飞速发展，取得了重大成果。我们相信，随着抗原纯化技术的进步，肉孢子虫免疫学诊断方法的准确性将进一步得到提高并形成标准化，使其更加广泛地用于肉孢子虫病的临床诊断、疗效考核以及流行病学调查。同时，肉孢子虫基因重组抗原的研究和应用不仅为改进肉孢子虫病的诊断提供了一条有效的途径，还促进了肉孢子虫免疫保护性的研究，加速了疫苗研制的进程。

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R392.1

B

1672－2639（2011）01－0015－03

2010－12－20；责任编辑 赵菊梅］

项目资助：国家自然科学基金（NO.30560022）