豫医卷毛大鼠表皮生长因子受体基因的比较生物学分析＊

章金涛,张明昊,王纯耀

1)郑州大学实验动物中心郑州 450052 2)河南中医学院基础医学院医学实验教学中心郑州 450008

△男,1968年 9月生,博士,教授,研究方向:分子遗传学,E-mail:jtzhang@zzu.edu.cn

豫医卷毛大鼠表皮生长因子受体基因的比较生物学分析＊

章金涛1)△,张明昊2),王纯耀1)

1)郑州大学实验动物中心郑州 450052 2)河南中医学院基础医学院医学实验教学中心郑州 450008

△男,1968年 9月生,博士,教授,研究方向:分子遗传学,E-mail:jtzhang@zzu.edu.cn

卷毛大鼠;表皮生长因子受体;同源性比较

目的:比较豫医卷毛大鼠与其他物种间表皮生长因子受体 (EGFR)基因及其编码蛋白的序列差异。方法:采用 RT-PCR方法对豫医卷毛大鼠 EGFR cDNA序列进行克隆、测序,并借助生物信息技术对BN大鼠、家鼠、黄牛、猕猴和人 EGFR基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列进行同源性比较和系统遗传学分析。结果:获得了豫医卷毛大鼠 EGFR基因全长 4 127 bp的 cDNA序列 (GenBank登录号:HM801041)。豫医卷毛大鼠与大鼠、小鼠、牛、猴和人等 5个物种 EGFR基因编码区的核苷酸序列同源性分别为 99.5%、93.1%、81.6%、83.3%和83.6%,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别是 99.8%、96.1%、87.4%、89.2%和 90.9%。结论:EGFR基因在进化过程中是一个高度保守并具有重要功能的“持家基因”。

表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)属于跨膜受体酪氨酸蛋白激酶家族,广泛存在于成熟组织中,参与调控细胞代谢、增殖、迁移和分化等生理过程[1]。卷毛突变是一种被毛和触须均发生弯曲的基因突变,如 wave-1、wave-2、cub和 s wh等[2-7],其中wave-2是 EGFR基因的点突变[3-5],突变的结果导致 EGFR蛋白的酪氨酸激酶活性下降。有些卷毛突变还具有一因多效性,伴发皮脂腺、乳腺、心脏和骨骼等发育异常,这些突变模型为研究毛发发育、组织分化、生长调节以及心脏等器官的疾病提供了较有价值的实验材料[8]。豫医卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat,YCHR)是 2006年 1月在SD大鼠种群中新发现的一种自发性突变动物,其卷毛性状受常染色体上单一显性基因控制,呈半显性遗传[9]。为深入研究 YCHR和其他物种 EGFR基因的同源性,作者克隆了 YCHR EGFR基因的cDNA序列,并与 GenBank上发布的其他物种的 EGFR基因编码序列进行了同源性比较,旨在进一步探讨哺乳动物 EGFR基因的同源性及其比较生物学特征。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄 YCHR 10只,雌雄各半,来自河南省实验动物中心,一级环境条件下饲养。

1.2 EGFR cDNA的扩增与测序 ①RNA的提取及处理:处死大鼠后立即取脑组织,用UN I Q-10柱总 RNA抽提试剂盒 (上海生工生物工程技术服务有限公司)提取总 RNA,保存于 -80℃冰箱中待用。②引物设计:参考大鼠 EGFR基因 cDNA序列(GenBank登录号:NM031507),用DNASTAR软件的 PrimerSelect程序分别设计 6对重叠引物 (表1)。③扩增与测序:取适量的总 RNA,用一步法反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行 RT-PCR。反应条件:50℃反转录 30 min;94℃预变性 2 min;94℃变性 45 s,Tm(表 1)退火 30 s,72℃延伸 1 min,共进行 35个循环;最后 72℃延伸 10 min。PCR扩增产物经纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 EGFR cDNA序列和氨基酸序列分析 拼接YCHR EGFR cDNA的完整序列,并从美国国立生物信息中心 http://www.ncbi.nl m.nih.gov下载相关物种(BN大鼠、家鼠、黄牛、猕猴和人)EGFR cDNA序列,采用DNASTAR软件和DNAMAN软件进行同源性比较与系统遗传学分析。

表1 EGFR基因cDNA扩增所用引物信息

2 结果

2.1 YCHR EGFR cDNA的克隆 RT-PCR产物大小与预期一致(图 1)。序列拼接示 YCHR EGFR cDNA全长序列为 4 127 bp(GenBank登录号:HM801041)。

2.2 EGFR基因的比较生物学分析 结果见表 2、3。系统遗传分析结果见图 2。EGFR基因的系统进化树显示,YCHR与其他大鼠同在一个进化分支,大鼠与小鼠亲缘关系也比较近,与牛、猴和人的亲缘关系较远,但其同源性≥80%。

图1 EGFR cDNA的PCR扩增产物

表2 YCHR与其他物种EGFR基因编码区核苷酸序列的同源性比较 %

表3 YCHR与其他物种EGFR氨基酸序列的同源性比较 %

图2 EGFR基因的系统进化树

3 讨论

作者对不同物种来源的 EGFR cDNA序列及其编码产物的氨基酸序列的同源性进行了分析,发现YCHR EGFR cDNA序列与其他 5个物种的同源性在 81.6%～99.5%,该基因编码产物的氨基酸序列的同源性在 87.4%～99.8%,表明该基因在进化过程中是一个高度保守并具有重要功能的“持家基因”,其编码蛋白在不同物种中可能具有相同的结构域。近年来有报道[10]指出,某些高度保守的单分子系统进化研究是相应物种基因组水平研究的重要证据和线索,因为对它的分析更能简便有效地揭示出某些蛋白质的结构与功能。就 EGFR基因及其编码蛋白而言,人类与模式生物之间存在着一定的序列与功能的异同,因此,可以利用这一特点,把其他物种来源的 EGFR基因作为人 EGFR基因天然存在的“突变体”,从而进一步揭示其结构与功能的特性本质。

综上所述,作者获得了 YCHR EGFR cDNA全长序列,初步了解了 EGFR基因在物种进化上的同源性与保守性,为今后开展 EGFR基因与毛发生长、皮肤及肿瘤等方面的分子遗传学研究积累了基础资料。

[1]柏素云,王蔚林,李冠武,等.EGFR-STAT3信号转导通路与肿瘤[J].肿瘤防治杂志,2004,11(9):989

[2]Luetteke NC,Qiu TH,Peiffer RL,et al.TGF alpha deficiency results in hair follicle and eye abnormalities in targeted and waved-1 mice[J].Cell,1993,73(2):263

[3]LuettekeNC,PhillipsHK,Qiu TH,et al.Themousewaved-2 phenotype results from a point mutation in the EGF receptor tyrosine kinase[J].GenesDev,1994,8(4):399

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[5]Fowler KJ,Walker F,AlexanderW,et al.A mutation in the epidermal growth factor receptor in waved-2 mice has a profound effecton receptor biochemistry that results in impaired lactation[J].Proc NatlAcad SciUSA,1995,92(5):1465

[6]Johnson KR,Lane PW,Cook SA,et al.Curly bare(cub),a new mouse mutation on chromosome 11 causing skin and hair abnormalities,and a modifier gene(mcub)on chromosome 5[J].Genomics,2003,81(1):6

[7]Kuramoto T,Morimura K,Nomoto T,et al.Sparse and wavy hair:a new model for hypoplasia of hair follicle and mammary glands on rat chromosome 17[J].J Hered,2005,96 (4):339

[8]Sundberg JP,KingLE Jr.Mouse mutations as animalmodels and biomedical tools for dermatological research[J].J InvestDermatol,1996,106(2):368

[9]章金涛,杜春燕,王纯耀,等.豫医卷毛大鼠的遗传特性[J].郑州大学学报:医学版,2007,42(4):626

[10]孙大庆,姜毓君,韩希妍,等.牛凝乳酶原基因克隆及序列的进化分析[J].遗传,2008,30(7):863

Comparative biology analysis of EGFR gene in Yuyi curly hair rats

ZHANG Jintao1),ZHANG M inghao2),WANG Chunyao1)1)Laboratory Anim al Center,Zhengzhou University,Zhengzhou 4500522)M edical Experim ental Teaching Center,School of B asicM edicine,Henan College of Traditional ChineseM edicine,Zhengzhou 450008

curly hair rat;epidermal growth factor receptor;homology comparison

Ai m:To study the difference of epidermal growth factor receptor(EGFR)gene and its coding protein between Yuyi curly hair rats and others species.Methods:RT-PCR technique was developed to clone and analyze the sequence of cDNA in EGFR gene from Yuyi curly hair rats,and biologic character of amino acid sequence encoding EGFR gene in different species(Norway rats,house mice,cattle,rhesus monkeys,and human).Results:A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 4 127 bp(Accession Number:HM801041).The identities of nucleotide of EGFR gene were 99.5%,93.1%,81.6%,83.3%,and 83.6%by homologous comparison among Yuyi curly hair rats and Nor way rats, house mice,cattle,rhesus monkeys,and human,and those of amino acid sequences were 99.8%,96.1%,87.4%, 89.2%,and 90.9%,respectively.Conclusi on:EGFR gene is a highly-conserved gene and important housekeeping gene.

Q953

(2010-07-27收稿 责任编辑徐春燕)