自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性下肢血管病变患者254例

许忆峰 杨晓凤 吴雁翔 王红梅 张轶斌 吕乃武 单鸿 崔激平 周金旭

缺血性下肢血管病变主要包括糖尿病足（diabetic foot,DF）、下肢动脉硬化闭塞症（atherosclerosis occlusion,ASO）、血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis,TAO）等，其表现为间歇性跛行、下肢的静息痛、溃疡及坏疽等，严重时需截肢甚至威胁生命，严重影响了患者的生活质量。由于其高危因素如老龄、糖尿病、吸烟、高血压和肥胖等因素的持续存在，该发病率有持续上升趋势。由于血管闭塞的情况复杂，单一的血管搭桥、支架、血管扩张和超声消融等治疗方法效果不甚理想。近年来干细胞疗法在缺血性下肢血管病变治疗中的应用越来越多，为难治性的下肢血管病变带来了新的希望[1]。我们对254例患有缺血性下肢血管病变的患者进行了自体骨髓单个核细胞移植治疗，进行了为期1年的自身前后对照研究，现报道如下。

对象与方法

一、一般资料

2003年11月至2008年8月期间，254例患者入组，年龄18～90岁，平均(56.8±15.8)岁，男167例，女87例。经临床症状、体征、下肢血管彩超、CT血管造影（computed tomographic angiography,CTA）及动脉造影检查等确诊为缺血性下肢血管病变，其中DF 96例(37.8﹪)，ASO 86例(33.9﹪)，脉管炎72例(28.3﹪)，按足部病变Fontaine 分级Ⅱ期38例，Ⅲ期190例，Ⅳ期26例，合并冠心病72例，高血压54例，血脂异常92例，脑梗死26例。患者均存在不同程度的间歇性跛行、下肢疼痛和难以愈合的缺血性溃疡等。

患者均接受常规药物治疗无效，且不适合行介入和搭桥手术，无严重心肝肾功能不全，无过敏体质、肿瘤史，无严重急性感染，经医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

所有患者均接受抗血小板治疗（如阿司匹林），部分患者接受钙离子拮抗剂等降压药、他汀类调脂药、胰岛素或口服降糖药物治疗，疼痛剧烈的患者予用二、三阶梯类止痛药物（如曲马多、羟考酮等），同时溃疡患者接受常规清创、减压、换药治疗，有感染患者根据药敏使用广谱抗生素治疗稳定感染，移植术前后的常规治疗基本保持不变。

二、病情的评估

观察移植术前后足部疼痛感觉、冷感、深感觉和间歇性跛行距离， 观察溃疡和坏疽情况。移植术前后用多功能红外线体温仪(瑞士Infraeye PICCOLO公司)检测足部皮温，深感觉测定仪(美国Bio-siometer公司)测定足部深感觉，多普勒血流探测仪（日本ES-1000SPM林电器株式会社）检测踝肱比，雷度多导联经皮氧分压测定仪(丹麦TCMTM400公司)测定足部经皮氧分压。病情进行Fontaine分期。所有检测均在室温（25.0±1.0）℃和湿度（50.0±20.0）﹪条件下进行，患者静息至少15min后测定。所有的指标于术前及术后3、6和12个月时重复测定。随访中严密观察是否有不良反应。

肢体感觉分级：（1）肢体疼痛分级标准：0级，无疼痛；1级：偶有疼痛；2级，经常疼痛，不需或偶用一般止痛剂；3级，经常疼痛，需经常用一般止痛剂；4级，疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解，需用麻醉性镇痛药。本组下肢疼痛情况：0级8例；1级33例；2级79例；3级88例；4级46例。（2）肢体冷感分级标准：0级，无冷感；1级，偶有受累肢体发凉、怕冷感；2级，常有受累肢体发凉、怕冷感；3级，受累肢体有明显冷、凉感，需要采用局部保温措施，症状才能得到一定程度的缓解；4级，受累肢体有明显的冷、凉感，采用局部保温措施症状也无明显改善。本组患者患肢均有不同程度的冷感，2级78例；3级99例；4级77例。（3）肢体跛行分级标准：按正常速度(60～70 m/min)行走。0 级，行走≥500 m，无疼痛；1级，行走400～499 m，有疼痛；2级，行走300～399 m，有疼痛；3级，行走100～299 m，有疼痛；4级，静息痛，无法行走，或仅行走< 100 m，即有疼痛。本组0级22例，1级44例，2级62例，3级80例，4级46例。（4）溃疡坏疽情况：本组合并溃疡61例，坏疽26例。

三、自体骨髓单个核细胞的采集和治疗方法

全部患者均使用rhG-CSF(吉粒芬，杭州九源药业公司)5 mg·kg-1·d-1术前皮下注射共2 d，进行骨髓单个核细胞动员。监测外周血常规值，干细胞动员第3天白细胞总数达（15.2～32.6）×109/L[平均（21.1±7.8）×109/L]。第3天行骨髓采集术，局部麻醉下从髂后上嵴抽取骨髓200ml，去除红细胞，密度梯度离心，分离出单个核细胞，再将收获的单个核细胞制成50ml左右的细胞悬液备用。计数细胞总量并测定CD34+及CD133+细胞含量（流式细胞仪，美国BD公司）。单次移植提取的单个核细胞总量平均为 ( 5.16±2.47)×108，其中 CD34+细胞含量为 (4.24±2.16)﹪，CD133+细胞含量为( 1.89±1.52)﹪。在手术室进行细胞移植术，将采集的单个核细胞配制成浓度为2.16×1010/L的细胞混悬液，依大血管走行，足部按1 cm×1 cm 间距行肌肉注射，小腿部位按3 cm×3 cm 间距，肌肉注射。

四、随访指标

所有患者均随访12个月。治疗前及治疗后3、6和12个月分别进行以下指标观察：（1）疼痛、冷感和跛行距离，观察溃疡和坏疽情况。（2）皮温、深感觉、经皮氧分压和踝肱比。

五、统计学处理

应用SPSS 11.5统计软件对数据进行统计学处理。计量资料用表示，皮温等指标的组间比较采用F检验，与基线组比较采用LSD检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者症状及体征变化(表1、表2)

（1）疼痛情况：疼痛消失18例(Ⅱ期18例)， 缓解139例(Ⅱ期17例，Ⅲ期112例，Ⅳ期10例)，无缓解97例(Ⅱ期3例，Ⅲ期78例，Ⅳ期16例)。缓解率61﹪(157 /254 )。（2）冷感情况：冷感缓解188例(Ⅱ期29例，Ⅲ期144例，Ⅳ期15例)，无缓解66例。缓解率74﹪(188 /254 )。（3）跛行情况：跛行延长102例(Ⅱ期23例，Ⅲ期72例，Ⅳ期7例)。好转率40﹪(102 /254 )。（4）溃疡情况：愈合18例，缩小18例，无变化15例，扩大10例。好转率59.0﹪(36 /61)。(5)坏疽情况：截肢6例，脱落愈合5例，无变化8例，扩大7例(图1、2)。

表1 254例不同Fontaine分期患者术后病情变化（例）

表2 254例不同Fontaine分期患者手术前后病情变化分级（例）

图1 缺血性下肢血管病变致右足溃疡患者干细胞治疗前后对比（一）

图2 缺血性下肢血管病变致右足溃疡患者干细胞治疗前后对比（二）

二、患者客观检查指标变化

患者移植部位的皮温、经皮氧分压及踝肱比均有升高(t=13.32，t=5.157，t=8.104)， 深感觉阈值降低（t=4.901）， P值均< 0.01，差异有统计学意义（表3）。

表3 254例不同Fontaine分期患者治疗后皮温、深感觉、踝肱比及经皮氧分压值（）

表3 254例不同Fontaine分期患者治疗后皮温、深感觉、踝肱比及经皮氧分压值（）

注：a与基线值相比 P < 0.05

移植后时间 皮温(℃) 深感觉(mV) 踝肱比 经皮氧分压(mm Hg)基线值 32.89±2.19 26.20±15.70 0.62±0.36 26.46±18.401周后 32.86±2.66 26.30±15.60 0.63±0.36 26.51±18.403个月后 34.05±1.76a 23.17±13.50a 0.72±0.30a 29.47±16.58a 6个月后 34.86±1.67a 21.59±12.00a 0.79±0.26a 31.80±15.60a 12个月后 35.52±2.26a 20.34±10.80a 0.84±0.24a 34.14±14.99a

三、不良事件

所有患者治疗后1～3 d 局部注射处有不同程度的胀痛， 无其他异常症状体征出现，心电图和肝肾功能无特殊改变。

讨 论

缺血性下肢血管病变是一种危害健康、降低患者生活质量、致残率较高的疾病，传统的药物、血管搭桥、介入手术和截肢术等治疗方法均有局限性。干细胞技术是近年出现的一项新方法，发展迅速并已有许多临床研究。根据发育阶段的不同，干细胞可分为胚胎干细胞与成体干细胞，成体干细胞根据其来源可分为骨髓干细胞、外周血干细胞、脐血干细胞及脐带干细胞等，根据干细胞分化组织不同还可分为造血干细胞及间充质干细胞，干细胞技术临床应用的理论基础是干细胞具有分化潜能，可分化成各种机体组织细胞，包括成血管细胞和血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）[2]，并进一步分化形成新生毛细血管[3]。

对于骨髓干细胞的研究目前相对较多，研究证实骨髓细胞可分泌诸如碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素1β等促进血管生成因子[4-5]。有动物实验表明，对缺血肢体行骨髓干细胞移植后，有新的血管内皮细胞及血管形成[6]。自体干细胞移植治疗缺血性下肢血管病变即利用此原理，将干细胞移植至缺血足部，使其分化形成新生毛细血管，改善并恢复局部血流。Tateishi-Yuyama等[7]最早使用骨髓单个核细胞(含内皮祖细胞)注射治疗因周围血管病导致的下肢缺血，治疗4周后，患者踝肱指数明显提高。动物实验显示将绿色荧光蛋白转染的骨髓单核干细胞移植到小鼠皮肤创伤处，局部环境可刺激干细胞移入，并分化为皮肤各种细胞和结构，表明骨髓单核干细胞移植可修复皮肤溃疡[8]。且骨髓单核干细胞也可通过释放促血管形成因子，促进溃疡愈合。2003年谷涌泉等[9]在国内首先开展了自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血的临床研究，发现大多数患者达到了避免截肢或降低截肢平面的目的。其后来的临床应用研究认为，自体骨髓单核干细胞移植治疗下肢缺血性疾病具有一定的疗效，而且疗效与移植干细胞总量有密切关系[10]。杨晓凤等[11]认为经动员后采用血细胞分离机采集的外周血单核干细胞，CD34+、CD133+细胞总数明显高于BMSCs，疼痛和冷感改善较BMSCs迅速，但干细胞移植前后临床症状及检查指标两组未见明显差异，且进行血细胞单采及大剂量骨髓动员剂对患者的身体状态要求相对较高，高龄及并发症较多的患者风险较大，骨髓采集则相对风险略小。李学峰等[12]对于血栓闭塞性脉管炎采用自体骨髓干细胞移植治疗，取得良好效果；很多临床研究都有力的支持了骨髓干细胞治疗缺血性下肢血管病变的疗效及安全性[13-14]。另外骨髓动员剂G-CSF刺激骨髓生成，使骨髓干细胞释放至外周血中EPC 数量增加[15]，趋化到缺血局部的EPC 相应增加[16]；可能亦会促进缺血局部的血管生成。本组观察发现移植后患者疼痛、冷感明显缓解，跛行距离延长，溃疡愈合或减小，足部和下肢皮温、踝肱比及经皮氧分压均升高，深感觉改善。因此我们认为自体骨髓单个核细胞移植是一种有效治疗下肢缺血性血管病的方法，尤其对非终末期患者改善症状明显，可促进溃疡愈合，无排斥反应，无明显副作用及并发症。

对于自体骨髓单个核细胞移植现在仍有许多问题有待进一步明确：（1）移植细胞的数量、种类、移植途径与疗效的关系；（2）移植干细胞的质量检测、动员多长时间为最适当；（3）如何分离较纯的CD34+细胞及体外增殖干细胞；（4）骨髓刺激后干细胞亚群如何变化，细胞因子在其中发挥何种作用，对缺血局部炎症反应及新生血管内皮细胞功能有何影响；（5）是否会出现远期并发症以及有没有致肿瘤的可能等。对以上问题的进一步研究有助于探讨自体骨髓单个核细胞移植改善下肢缺血的机制，为进一步提高自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血的疗效提供理论基础。而随着研究的深入，相信这些问题会逐渐得到解决。

1 王爱红,许樟荣.干细胞移植——治疗糖尿病缺血性下肢血管病变的新手段[J].国外医学：内分泌学分册,2005,6:430-432.

2 Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275:964-967.

3 赵玉国,金毕,李毅清.自体骨髓干细胞移植诱导血管生成的作用[J].华中医学杂志,2004,28(3):173-174.

4 Shi Q,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulation bone marrow derived endothelial[J].Blood,1998,92(2):362.

5 Hamano K,Li TS,Kobayashi T,et al.The induction of angiogenes is by the implantation of autologous bone marrow cells:A novel and simple therapeutic method[J].Surgery,2001,130(1):44.

6 Kawamoto A,Asahara T,Losordo DW,et al.Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization[J].Cardiovasc Radiat Med,2002,3(3-4):221-225.

7 Tateishi-Yuyama E,Matsubara H,Murohara T,et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial[J].Lancet,2002,360(9331):427-435.

8 Wu Y,Chen L,Scott PG,et al.Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis[J].Stem Cells,2007,25(10):2648-2659.

9 谷涌泉,张建,齐立行,等.自体骨髓单个核细胞移植治疗慢性下肢缺血94例不同病变分期患者的效果比较[J].中国临床康复,2005,9 (38):7-10.

10 谷涌泉,张建,齐立行,等.不同移植浓度自体骨髓干细胞治疗下肢缺血临床疗效的影响[J].中国修复重建外科杂志,2006,20(5):504-506.

11 杨晓凤,吴雁翔,王红梅,等.自体外周血和骨髓干细胞移植对缺血性下肢血管疾病患者缺血状态改善的临床研究[J].中国实用内科杂志,2007,27(14):1126-1129.

12 李学锋,沈振亚,谷涌泉,等.自体骨髓干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎[J].中国普外基础与临床杂志,2010,17 (7):656-658.

13 许忆峰,杨晓凤,吴雁翔,等.自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病:43例6个月后疗效评估,中国组织工程研究与临床康复,2007,11(3):534-535.

14 曾昭凡,唐新华,熊吉信,等.自体骨髓干细胞移植治疗下肢慢性缺血性疾病的疗效观察[J].中国普通外科杂志,2010,19(6):646-650.

15 Leone AM,Valgimigli M,Giannico MB,et al.From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelial progenitor cells[J].Eur Heart J,2009,30(8):890-899.

16 Schimieguel DM,Dominato JA,Zattar KC,et al.Does mobilization for autologous stem cell transplantation damage stromal layer formation[J].Hematology,2009,14(2):76-83.