骨形成蛋白Ⅱ型突变受体基因转染对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响

傅升 吕红兵 刘源 何黎升 樊丽娜 金岩

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）家族成员都是通过结合两种丝或苏氨酸激酶受体（即 BMPsⅠ型、Ⅱ型受体）发挥作用的，Ⅰ型、Ⅱ型受体与配体结合形成异聚体，从而将BMPs信号传递给下游作用物[1-3]。目前已发现BMPs对靶细胞的生长、分化以及凋亡具有调控作用，此外还发现BMPs不仅与部分骨源性肿瘤的发生发展有密切关系，而且与部分涎腺肿瘤、胃癌以及前列腺癌等生物行为有关[4-6]，但对BMPs与鳞癌的发生、发展及转移的关系尚不清楚。

为分析和认识BMPs与鳞癌的发生、发展及转移的可能关系，本研究将首次观察BMPs在口腔鳞癌(舌癌细胞系Tca8113细胞)中的表达以及BMPⅡ突变受体基因转染对口腔鳞癌生长的影响，这将有助于深入认识口腔上皮恶变的机理，为今后应用生物技术对口腔鳞癌进行有效治疗提供实验依据。

材料和方法

一、材料

Tca8113细胞由第四军医大学口腔医学院生物实验室提供。FuGENE6 Transfection Reagent Kit、 DIG-DNA labelling and detection kit、BrdU 检测试剂盒为 Boehringer Mannbeim公司产品。Pc-4质粒为含有BMPsⅡ型突变受体cDNA（cDNA由日本KaWaSaKi医学院分子生物所的Nohno教授提供）的真核表达载体。流式细胞仪：Coulter Epics Elite ESP。MTT为美国Sigma公司产品。Cyclin D1、p27单抗及CDK4、p57多抗购自美国Santa Cruz公司，LSAB增强性广谱型免疫组化试剂盒购自丹麦 Dako公司。

二、方法

1.Tca8113细胞培养：用含10﹪胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5﹪CO2、饱和湿度下培养，3 d换液1次，传代3～4次使细胞达到良好的生长状态。

2.BMPsⅡ型突变受体基因的转染和鉴定：按试剂盒说明书进行操作和转染后的鉴定。

3.原位杂交：按试剂盒说明书进行标准化的检测。阴性对照用PBS代替探针，用Tca8113细胞培养方法进行培养。

4.MTT 检测：在96孔板上以4×103的密度接种前述两组细胞。培养3 d后，每孔加入MTT(5 mg/ml )20μl，继续培养 4 h，吸弃上清，加入 150μl DMSO 振荡 15min，用酶联免疫检测仪测定490 nm的吸光度（A）值。

5.BrdU 检测：实验前1d接种前述两组细胞到放有玻片的培养板中，每种细胞接种10个玻片。到实验时细胞密度50﹪～80﹪。吸弃培养液，加入含0.01﹪BrdU的培养液，继续培养1h，取出细胞爬片用抗-BrdU单抗检测，计数阳性细胞。

6.流式细胞仪( flow cytometry,FCM)检测：取细胞5×105，离心半径10 cm,800 r/min，离心5min，弃上清，用PBS洗2次，70﹪乙醇固定，4℃过夜。上机前离心去除乙醇，PBS洗2次，加入溴化丙锭染液1ml，4℃闭光染色30min,上机检测分析。

7.凋亡细胞的TUNEL法染色：细胞爬片经Triton-100处理后，PBS振洗5min，共3次，平衡Buffer 1min，TdT酶37℃孵育1h后，中止Buffer 1min，BufferⅠ、BufferⅡ依次充分洗涤。2﹪正常羊血清封闭30min后，滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体（1:150），37℃孵育2h后,BufferⅠ、BufferⅢ充分洗涤，NBT/BCIP暗处显色2h，TE中止反应，甲基绿复染，常规脱水透明封片。凋亡的阳性信号为位于细胞核中的蓝黑着色。每个标本均取不相重复的高倍视野，共计数500个细胞核，由此获得凋亡指数（apoptosis index,AI）=凋亡细胞/所有记数细胞。

8.免疫组化检测Tca8113、tBRII-Tca8113细胞中CyclinD1、CDK-4、p27和p57的表达和定量分析：按标准化的免疫组化方法进行染色，阴性对照用PBS代替一抗，其他同前。Cyclin D1与 CDK4 在细胞中的阳性信号均为覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒，p27和p57的阳性信号为胞浆着色。用免疫组化定量系统，对正常组和实验组进行测量，每次测量前，都以统一的空白片作标准，调整系统光度值，设定标准灰度，在同一灰度条件下，避开无细胞的区域，每张切片选择5个不同的视野，用鼠标按细胞的形态画出细胞轮廓，自动测量，选平均灰度为测量指标，放大倍数为400倍。系统设定白色最大灰度为256，黑色最小灰度为0。因此，灰度值越小，代表其阳性反映程度越高。

三、统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，加药前后A值差异用配对t检验，tBRII-Tca8113和Tca8113两组BrdU和灰度差异用比较采用独立t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞克隆

转染细胞经G-418筛选，2周后得到抗G-418的阳性细胞克隆，而未转染细胞在含G-418的培养液中逐渐全部死亡，初步证明BMPsⅡ型突变受体基因的转染成功（图1）。

二、neo 基因的原位杂交

在转染细胞的胞桨中有蓝色颗粒样阳性杂交信号(图2)，进一步证明BMPsⅡ型突变受体基因的转染Tca8113细胞成功，并有BMPsⅡ型突变受体mRNA的表达，未转染细胞未见阳性信号。

三、MTT 检测

转染 BMPsⅡ型突变受体后，tBRII-Tca8113 细胞增殖活力变慢，与Tca8113细胞相比较差异具有统计学意义（见表1，图3）。

四、BrdU 检测

结果显示，转染 BMPsⅡ型突变受体后，与 Tca8113细胞（12.0±3.4）相比 ,tBRIITca8113细胞（23.0±1.9）DNA合成变慢，细胞增殖力下降，两者比较差异具有统计学意义（t=8.3013,P=0.000,表 2，图 3）。

五、细胞周期分析

tBRII-Tca8113 细胞与Tca8113细胞相比，反应细胞增殖活力的增殖指数PrI为9.1和14.7（见表3，图3），结果与MTT检测一致。

图1 转染后细胞克隆（倒置显微镜）（×100）

图2 neo基因的原位杂交，提示在转染的细胞中有蓝色颗粒阳性杂交信号（×100）

图3 MTT,BrdU,FCM分析结果

六、凋亡分析结果

转染后tBRII-Tca8113细胞中的凋亡数目明显增加，两者之间的凋亡指数（3.7±1.2，8.7±1.6）比较差异具有统计学意义（t=7.906，P=0.000，见图 4)。

七、Cyclin D1、CDK4 、p27 和p57 表达的定量结果

Cyclin D1、CDK4 、p27和p57 的免疫组化染色结果（图5～8）。用图像分析系统对Cyclin D1、CDK4、p27和p57的表达进行平均灰度的测量，两者之间各种细胞周期蛋白的表达差异具有统计学意义（见表4，图9)。

表3 tBRII-Tca8113细胞与Tca8113细胞 FCM 分析结果

表4 CyclinD1、CDK4、p27、P57 的灰度测量值比较

图4 转染前后凋亡染色结果和凋亡的指数直方图

图5 CyclinD1免疫组化染色结果（免疫组化染色×100）

图6 Tca8113细胞与 tBRII-Tca8113细胞Cyclin D1表达比较（免疫组化染色×100）

图7 p27免疫组化染色结果（免疫组化染色×400）

图8 p57免疫组化染色结果（免疫组化染色×400）

图9 Cyclin D1、CDK4、p27和p57在Tca8113和tBRII-Tca8113细胞中的平均灰度测量值

讨 论

Heikinheimo等[3]研究正常涎腺组织中 BMP-6 的表达发现，在成人颌下腺的腺泡细胞中有BMP-6 的低表达，而其他类型的细胞则无表达；BMP-6 在腮腺和颌下腺的浆液性腺泡细胞中有特异性免疫定位点。Yang等[7]于1993较早观察并证实了 BMPs在涎腺多形性腺瘤中的表达，并认为其表达可能与多形性腺瘤中的软骨样组织的形成有关。Harris等[8]发现 BMP-6不仅在正常的前列腺中表达，而且在前列腺癌中出现高表达，认为可能与前列腺组织具有异位成骨的能力有关。上述肿瘤性上皮细胞出现的 BMPs 表达，作者都认为可能与这些肿瘤组织中的骨、软骨样组织形成有关。除此之外，BMPs是否参与了对上皮组织恶变的调控，这种调控是由于BMPs基因突变所至，还是由于其他因素导致 BMPs 信号表达水平的改变，目前尚未得出明确结论。本研究以 BMPsⅡ型突变受体基因为目的基因，以 Tca8113 细胞（人舌鳞癌细胞）为载体细胞，建立稳定表达 BMPsⅡ型突变受体的 Tca8113 细胞，以便进一步从信号转导水平探讨 BMPs 信号表达水平的改变和 BMPs 基因突变在口腔上皮组织恶变和口腔鳞癌发生发展过程中的作用。

本研究中转染 BMPsⅡ突变受体的 Tca8113 细胞，通过 G-418 筛选，初步确认了表达突变受体的细胞克隆；再用 neo 基因检测，进一步证实了转染的成功。这表明转染 BMPsⅡ突变受体的 Tca8113 细胞已被建立，也进一步表明 Tca8113 细胞是 BMPs 的靶细胞，BMPs 及其受体可能在口腔上皮组织的恶变过程中有重要作用。我们将转染成功的 Tca8113 细胞命名为 tBRII-Tca8113 细胞。

转染前后稳定表达 BMPsⅡ型突变受体的 tBRII-Tca8113 细胞和Tca8113 细胞相比，形态未见明显变化，但是通过 MTT、流式细胞仪及反应细胞 DNA 增殖水平的 BrdU 检测，我们发现转染后，细胞的增殖活力明显下降。转染 BMPsⅡ型突变受体后，细胞内的 BMPs 信号分子的表达被阻断，同时细胞的增殖出现下降，两者间有何相关性，以往的相关研究显示，BMPs 信号表达水平在口腔鳞癌组织中较口腔正常上皮组织有明显增强,结合本实验的结果推断 BMPs 信号表达水平的改变在上皮细胞的恶变过程中起着相当的促进作用，而不仅仅是由于其他因素导致 BMPs 信号表达水平的改变。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。对细胞周期调控的研究使人们认识到，细胞周期失控是癌变的重要原因[9]。细胞周期的调控机制十分复杂，主要受到3类因子的调控，即细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）组成，其中细胞周期蛋白是调节亚基，CDKs是催化亚基，在调控细胞周期的进程中，常暂时结合形成复合物而发挥作用，CKIs是近年来刚分离得到的一类很重要的细胞周期的负性调控蛋白，这些蛋白在体外通过与CDKs、cyclins或cyclin-cdks复合物结合达到抑制CDK催化外源性底物的活性。目前已知的细胞周期蛋白和CDKs包括 cyclinsA，B1-2，C，D1-3，E，F，G，H和CDKs1-7[10-11]。而CKIs可分为两个族 ：第一族包括p15、p16、p18 、p19，这些蛋白内包含独特的四次锚蛋白结构（这个名称有无错误需咨询）；第二族包括p21、p27、p57，它们在氨基N端有显著的序列同源性，均有一个广谱的cyclin-cdks复合物作用位点[11-12]。正常情况下，Cyclin D1在G1期是恒定的，其过量表达可导致G1期缩短，细胞分裂速度加快。对肝细胞癌、胃肠癌、子宫内膜癌、肺癌、骨肿瘤的研究表明，Cyclin D1在这些肿瘤中均有过量的表达[10]。

Cyclin D1和CDK4在肿瘤细胞的细胞周期循环发生障碍，Cyclin D1表达产物的堆积将使肿瘤细胞的G1期缩短，引起细胞的过度增殖。本研究显示，转染了突变受体的口腔舌癌细胞tBRII-Tca8113中Cyclin D1和CDK4的表达均显著低于正常的 Tca8113 细胞，此外，细胞周期复性调控蛋白p27和p57的表达高于正常的Tca8113细胞。该结果与前述研究4项吻合，表明转染了 BMPsⅡ型突变受体后，BMPs信号转导水平的改变与细胞周期相关因子的表达有较强的相关性。即转染了 BMPsⅡ型突变受体后，肿瘤细胞的增殖显著减弱，表明BMPs信号的表达在口腔舌癌细胞的恶性变化中起着重要作用。此外，在tBRII-Tca8113细胞中凋亡的表达与Tca8113细胞相比增强，BMPs信号的改变影响了癌细胞中凋亡机制的表达，细胞的恶性程度发生了改变。

BMPs信号的表达在口腔舌癌的恶性变化中起着重要作用,本研究结果有可能对口腔舌癌的基因治疗提供新的思路。

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6 Harris SE,Harris MA,Mahy P,et al.Expression of bone morphogenetic protein messenger RNAs normal rat and human prostate and cancer cells[J].Prostate,1994,24(4):204-211.

7 Yang LJ,Jin Y,Nakamine H,et al.An immunohistochemical study of bone morphogenetic protein in pleomorphic adenoma of the salivary gland[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol,1993,422(6): 439-443.

8 Harris SE,Harris MA ,Mahy P,et al.Expression of bone morphogenetic protein messenger RNAs normal rat and human prostate and cancer cells[J].Prostate,1994,24(4): 204-211.

9 Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle,CDKs and cancer: a changing paradigm.Nature,2009,9(3):153-166.

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