人类白细胞抗原半相合供者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期原发性肝癌二例

叶扶光 许怡薇 姚尚志 张鑫 肖漓 马锡慧 高钰 冯凯 石炳毅

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells,CIK）是一种新型免疫活性细胞。其兼有 T 细胞抗瘤活性和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限性杀瘤的特点，杀伤活性可达 84.7﹪[1]。与淋巴因子激活的杀伤细胞（ lymphokine-activated killer,LAK ）和肿瘤浸润淋巴细胞（ tumor infiltrating lymphocyte,TIL ）相比，CIK 具增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广和毒副作用小等优点[2]。实验证实，同正常人的 CIK 相比，肝癌患者 CIK 的增殖速度较慢且增殖倍数也有所降低[3]。晚期肝癌患者耐受力差，且患者自体淋巴细胞往往存在严重的免疫抑制，直接影响自体过继性免疫治疗的效果。所以我们为2例晚期肝癌患者回输取自人类白细胞抗原( human leucocyte antigen,HLA )配型半相合直系亲属健康供者的单个核细胞所培养获得CIK细胞，回输于患者用于其肝癌治疗。现就其近期疗效报道如下。

资料与方法

一、病例选择

于2010年7月至2010年9月于解放军第三〇九医院器官移植中心细胞治疗科诊治的2例肝癌患者。诊断符合 1999 年第 4 届全国肝癌学术会议通过的原发性肝癌诊断标准诊断，且CIK细胞治疗与其他治疗间隔4周以上。

患者1：男性 33 岁，经影像学、细胞学及病理学检查确诊，在行CIK治疗前行3次介入栓塞化疗，1次全身化疗，治疗无明显效果。患者肝脏弥漫性占位病变，门静脉主干及其分支癌栓形成、海绵状门脉，两肺多发转移，脾大，肝硬化。

患者2：男性 48 岁，经影像学、细胞学及病理学检查确诊，在行 CIK 治疗前行3次介入栓塞化疗，手术1次。肝癌根除术后复发，患者肝多发占位，肝硬化，腹水，脾大，黄疸。

二、供者选择

患者1供者为其亲生父亲，患者2供者为其亲生女，两供者均经HLA配型证实与受者HLA配型为半相合

三、CIK 细胞制备

采用费森尤斯细胞分离机循环5000ml之后的健康供者 PBMC 用 Ficoll 分离并收集单个核细胞，用 RPM I -1640洗涤 3次，按 2×106/ml 悬浮于RPM I-1640完全培养基中。参照美国斯坦福大学骨髓移植中心建立的 CIK 细胞培养方法：第0天加入IFN-γ 500 U/ml，置于37 ℃，5﹪CO2培养箱中培养24 h，第1天加入IL-2300 U/ml，CD310 μg/L，IL-1100 U/ml继续培养，每天观察细胞生长并根据情况进行扩增。以后每 3 d换液 1次并调整细胞数为（1～2）×109/L，在37℃，5﹪ CO2培养箱中连续培养10～12 d后计数。CIK 细胞培养14～28 d后，取少量培养细胞做免疫组化检测，当 CD3+、CD56+细胞数≥65﹪，CD3+、CD8+细胞≥35﹪，且微生物学检查阴性时收集细胞。

四、CIK 免疫表型检测

在 CIK 培养的第 0 天和第 14 天分别抽取少量细胞，用流式细胞仪行免疫表型分析，查 CD3+/CD56+及 CD3+/CD8+细胞比例。

五、CIK 细胞回输

分 3次回输于患者，每次间隔1d，一次回输量为 1×109～1.5×1010。回输同一天开始静脉输注IL-2200万U，连续14 d。

六、疗效观察

分别检测患者治疗前后的临床症状变化；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,ASP)变化；卡氏评分改变；甲胎蛋白（Alphafetoprotein，AFP）及CA199的改变。

七、毒副作用观察

观察患者是否有发热、寒战和血压降低等。

结 果

一、CIK免疫表型

第0天2例供者CD3+、CD56+细胞分别约占3.4﹪及 5.1﹪，CD3+、CD8+细胞约占 23.2﹪及28.8﹪；第14天 CD3+、CD56+细胞约占 10.4﹪及23.4﹪，CD3+、CD8+细胞约占 47.2﹪及 80.5﹪。

二、疗效观察

2例患者接受 CIK 治疗后食欲、体力均较前有好转，体重增加，肝区疼痛减轻，腹腔积液减少，黄疸减轻。复查 CT 肿瘤均有不同程度缩小，较治疗前卡氏评分提高分别提高15分和20分，肿瘤标志物及肝功能变化见表1。

表1 CIK 细胞治疗前后肿瘤标志物及肝功变化

三、毒副反应

患者1第一次输注 CIK 细胞后曾出现一过性发热，给予对症退热后好转。后 2次输注过程顺利，在不服用退热药情况下2h后体温恢复正常。患者 2 在输注 CIK 细胞后出现呼吸困难，高热，血压降低至 90/60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），考虑为急性过敏反应引起，给予地塞米松治疗后症状逐渐缓解。

讨 论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率上升速度仅次于肺癌。原发性肝癌和继发性肝癌手术切除率只为15﹪～30﹪，目前治疗肝癌手段主要是手术、化疗及放疗，肝移植也是目前常用的方法，但供体有限，且仅限于早期肝癌。以上方法均难以长期改变患者的生存质量。过继免疫疗法具有一定的抗肿瘤效果，免疫活性细胞在体内能直接杀伤肿瘤细胞，且能调节和增强机体的免疫功能。因此，过继免疫疗法已成为肿瘤治疗的辅助手段之一，为预防肿瘤复发、消除患者体内残留的肿瘤细胞和改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的治疗途径[4]。

进展期的恶性肿瘤诱导机体产生明显的免疫耐受现象，患者自体淋巴细胞往往存在严重的免疫抑制[5]，直接影响自体过继性免疫治疗的效果。但是，如果 CIK 细胞来源于异基因健康供者效果较好，因为半相合的淋巴细胞可以识别受者肿瘤抗原及其 MHCⅠ/Ⅱ类分子，所以异体免疫细胞具有较晚期肿瘤患者自体细胞强得多的抗肿瘤活性。其中，供者的 T 细胞是诱导疾病缓解的最重要的免疫细胞[6-11]。

韩颖等[12]曾报道 HLA 半相合供者外周血活化干细胞治疗晚期实体瘤 42例，取得了很好的效果，存在的问题是 GVL 效应需要移植术后4～6个月才会发生，存在一定的局限性。本研究通过 HLA 配型确定供受者半相合后，采集健康供者外周血单个核细胞送实验室培养 CIK 细胞，再分 3次回输，一方面可以保留异基因 CIK 细胞抗肿瘤的强大活力，另一方面，大量的活化免疫细胞直接进入患者体内可以直接杀伤肿瘤细胞，从而为晚期肝癌患者争取宝贵的治疗时间，同时副反应与传统的自体 CIK 细胞也无明显差别。2例患者均可耐受，未出现大的副作用及并发症，患者治疗后AFP，临床症状比治疗前有明显改善，卡氏评分有显著提高,治疗效果较明显。晚期肝癌患者耐受力差，已经失去了手术机会，对于化疗也可能因为身体原因无法耐受。但细胞治疗反应温和，安全有效，可改善患者临床症状，提高生活治疗。但目前病例数较少，在未来的研究中将增加更多病例以论证其可行性。。

1 Wang F S,Liu M X,Zhang B,et al.Antitumor activites of human autologous cytokine - induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J].World J Gastroenterol,2002,8(3):464- 468.

2 Kaneko T,Fusauch Y,Kakui Ye,et al.Cytotoxicity of cytokine induced killer cells coated with bispecific antibodya gainst acute myeloid leukemia cells[J].Leukemia & Lymphoma,1994,14(3-4):219-229.

3 杜清友,刘明旭,王福生,等.CIK细胞体内外抗肝癌细胞作用[J].中国癌症杂志,2001,11(4):325-327、330.

4 Hoffman DM,Gitlitz BJ,Belldegrun A,et al.Adoptive cellular therapy[J].Semin Oncol,2000,27(2):221- 233.

5 Ruggeri L,Mancusi A,2 Burchielli E,et al.NK cell alloreactivity and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].Blood CellsMol Di s,2008,40 (1):84-90

6 Mavoungou E,Sall A,Poaty-Mavoungou V,et al.Alloreactivity and association of human natural killer cells with the major his to compatibility complex[J].Clin Diagn Lab Immunolo,1999,6(2):254-259.

7 Van der Harst D,Goulmy E,Falkenburg JH,et al.Recognition ofminor histo-compatibility antigens on lymphocytic and myeloid leukemic cells by cytotoxic T-cell clones[J].Blood,1994,83(4):1060-1066.

8 Appelbaum FR.Haematopoietic cell transplantation as immuno therapy[J].Nature,2001,411(2):385-389.

9 Truitt RL,Atasoylu AA.Contribution of CD4+and CD8+T cells to graft-versus-host disease and graft-versusleukemia reactivity after transplantation of MHC compatible bone marrow[J].Bone Marrow Transplant,1991,8(1):51-58.

10 Lewalle P,Hensel N,Guimaraes A,et al.Helper and cytotoxic lymphocyte responses to chronic myeloid leukemia:implications for adoptive immunotherapy with T cells[J].Br J Haematol,1996,92(3):587-594.

11 Faber LM,van Luxemburg Heijs SA,Rijnbeek M,et al.Generation of leukemia reactive cytotoxic T lymphocyte clones from the HLA identical bonemar-donor of a patient with leukemia[J].J Exp Med,1996,176(5):1283-1289.

12 韩颖,于津浦,李慧,等.HLA半相合外周血活化干细胞治疗晚期实体瘤的疗效[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2010,17(1):7-12.