黄芪甲苷促进心肌干细胞分化的作用研究

廖联明 郑友生 江敏 赵素萍

随着人们生活水平的提高，心脑血管疾病成为城乡居民死亡的第一杀手。根据卫生部公布的《2010中国卫生统计年鉴》，我国城市每十万人中已经有235人死于心脑血管疾病。急性心肌梗死是心血管疾病中的一个非常严重的类型，患者部分心肌因严重而持久的缺血发生局部坏死，从而导致心脏功能的严重损害。以往认为心肌梗死是一个不可逆的损伤，无论什么方法均不能使心肌疤痕组织重新变成有收缩功能的心肌组织。此外对于终末期的心功能不全患者，心脏移植是挽救他们生命的唯一办法。由于心脏来源的有限和其昂贵的费用，只有少数患者有机会接受心脏移植治疗。因此迫切需要建立其他有效的疗法。

最近10年干细胞技术的发展使细胞治疗在心脏病中的应用达到了一个新的高潮。短短的几年心肌梗死的骨髓源干细胞治疗即从动物试验过渡到了临床[1-3]。但移植的骨髓源干细胞分化而成的心肌细胞和受者的心肌细胞的电生理特性不完全一样，可能产生心率失常。近年的研究认为，在心肌中存在心肌干细胞，在急性心肌梗死和慢性心衰患者的心肌可检测到被激活的心肌干细胞[2-7]。由于心肌干细胞的激活程度不高，不能对受损的心肌进行有效的修复，因此如何通过小分子药物激活患者的心肌干细胞，让他们充分增殖和分化，是心肌干细胞研究的重点之一。本研究采用免疫磁珠的方法分离Sca-1+心肌干细胞，并探索黄芪甲苷对其分化的影响。

材料和方法

一、试验动物和试剂

6～12周龄的昆明种小鼠购自福建医科大学吴氏实验动物中心。黄芪甲苷购自中国药品生物制品检定所。胶原酶购自Sigma公司。抗生物素抗体磁珠为德国Miltenyi Biotec公司产品。其他试剂购自武汉博士德生物技术有限公司，化学试剂为分析纯。

二、Sca-1+心肌干细胞的分选

[8]报道的方法，将6～12周龄的C57BL/6小鼠心脏取出后以0.025﹪的胶原酶灌注，剪碎心肌，以0.1﹪的胶原酶37℃ 消化30min。这种消化过程对成熟的心肌细胞是致死性的。消化后的细胞过70 µm的筛网后以Sca-1抗体-生物素复合物标记，再以抗生物素抗体磁珠分选2次。分选的细胞以DMEM 培养基继续培养。DMEM 培养基含10﹪小牛血清、100 U/ml 青霉素 G、100µg/ml链霉素、2mmol L-谷氨酰胺、25mmol HEPES、10 ng/ml EGF和10 ng/ml SCF。

三、心肌干细胞的分化诱导

按参考文献[8]报道的方法，将心肌干细胞以5×103/ml的密度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内，制备细胞爬片。每孔加入2ml DMEM-M199 (4:1)培养基，内含10﹪马血清、5﹪FBS、青霉素 (100 U/ml)、链霉素 (100µg/ml) ；2mmol/L L-glutamine 和黄芪甲苷 ( 终末浓度为20和200mg/L)。对照组只加培养液。72h后吸出培养基，小心加入磷酸缓冲液轻轻冲洗2次后，再加入4﹪多聚甲醛/磷酸缓冲液室温固定15～20min。参照EliVision Plus试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色，检测特异性心肌细胞标志蛋白desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。显色剂为二胺基联苯胺（diaminobenzidine,DAB），阳性显色为棕色，以未诱导细胞作对照。

结 果

一、心肌干细胞的分离

根据文献[8]报道的方法进行分选。心肌细胞分选前6.1﹪表达Sca-1。经磁珠分选后的细胞，流式细胞仪检测的结果显示93.2﹪表达Sca-1（图1）。此外，细胞不表达造血干细胞标志CD34和白细胞标志CD45。CD31也不表达。

二、心肌干细胞的分化潜能

终末浓度为 250mg/L的黄芪甲苷诱导4周的干细胞呈多边形，有伪足，伪足可相互接触。免疫组化染色显示细胞表达desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。而未诱导的细胞和20mg/L的黄芪甲苷诱导的细胞desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT 均为阴性。说明黄芪甲苷有促进心肌干细胞分化为心肌细胞的潜能(图2 )。

图1 心肌干细胞的表型测定

图2 黄芪甲甙对心肌干细胞分化的影响

讨 论

在哺乳动物的成长过程中，心脏的扩大既依赖于心肌细胞的增殖，同时伴随细胞体积的增大。在成长的初期主要依赖心肌细胞的增殖，然后逐步过渡到依赖于细胞体积的增大，在成年期以后一般认为心肌细胞就不太增殖了。这种观点的产生主要基于以下事实：一方面心脏损伤后其功能很难有明显的恢复，也未观察到心肌细胞的再生；另一方面，在成人原发性的心脏肿瘤几乎没有。

虽然这些事实表明心肌细胞几乎没有再生能力，但并不能排除心肌细胞有一定的再生能力。1977 年 Rumyantsev等[9]曾经指出在成年哺乳动物的心室肌存在有限的细胞可合成DNA，进入细胞分裂周期。他还指出在心房及冷血动物的心脏，心肌细胞的分裂能力更大。Beltrami等[4-5]推测在慢性心脏衰竭的长时间的负荷下，心肌细胞可能已经在经历了有限的分裂后慢慢失去了再生能力。因此他们采用急性心肌梗死后的心脏进行研究。在发作心脏病7～17 h后死亡的13例患者中，他们发现，受损伤部位的心肌细胞会在一定程度上重新分裂、增殖许多天，离损伤部位较远的少数心肌细胞同样会分裂、增殖。这项研究成果更新了心肌不能再生的传统观点。他们将这13例患者的心脏与死于其他原因的另10例患者的心脏对照后发现：死于心脏病发作的13例患者的梗死心肌边缘部位，细胞分裂是死于其他原因的10例患者的84倍；较远的心肌组织细胞分裂，前13例患者是后10例患者的28倍左右。

2003 年 Oh 等[6]进行了心肌细胞的首次分离。他们首先将6～12周龄的 C57BL/6 小鼠心脏取出后以 0.025﹪ 的胶原酶灌注，以0.1﹪的胶原酶消化。消化后的细胞过采用磁珠法分离出的Sca-1+心肌。心肌干细胞在5-氮胞苷的作用下，细胞表达肌节α-肌动蛋白和肌钙蛋白 -I。

1995年Wakitani等[10]发现5-氮胞苷可以将骨髓间充质细胞诱导成为骨骼肌细胞。此后Konieczny和Emerson[11]发现5-氮胞苷也可诱导小鼠胚胎细胞系向心肌细胞分化，并证实这类细胞含有肌细胞源性决定族，在甲基化状态呈现转录失活，而在5-氮胞苷作用下，即去甲基状态下，肌细胞决定族转录激活，从而使该类细胞分化为心肌细胞。5-氮胞苷的这种作用在诱导心肌干细胞向心肌细胞分化试验中也得到证实[6,8]。5-氮胞苷作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用，因此有必要寻找更安全有效的诱导剂。

中药在治疗心肌梗死方面的作用已经得到证实。本研究有理由相信中药中的一些小分子化合物可能通过不同的途径抑制细胞的凋亡，促进细胞的增殖，从而发挥中药的疗效。冼绍祥等[12]通过筛选发现中药单体黄芪甲苷可诱导间充质干细胞分化成心肌样细胞。此外陈嘉等[13]报道丹酚酸B能诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。根据他们的研究结果，本研究采用黄芪甲苷诱导心肌干细胞，也发现具有很好的诱导作用。

心肌干细胞的潜在应用价值还未被完全开发之前，有许多问题需要回答，尤其是其分化为心肌细胞的机制。进行中药诱导心肌干细胞分化为心肌细胞的探索，将为应用中医药治疗心肌梗死提供新的理论依据。此外中药有可能与细胞移植的方法相结合治心肌梗死，有广阔的应用前景。

参考文献

1 Grauss RW,Winter EM,van Tuyn J,et al.Mesenchymal stem cells from ischemic heart disease patients improve left ventricular function after acute myocardial infarction [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(4):H2438- H2447.

2 Soonpaa MH,Field LJ.Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis [J].Circ Res,1998,83(1):15-26.

3 Laugwitz K,Moretti A,Lam J,et al.Postnatal isl1+cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages[J].Nature,2005,433(7026):647-653.

4 Beltrami AP,Urbanek K,Kajstura J,et al.Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction[J].N Engl J Med,2001,344(23):1750-1757.

5 Beltrami AP,Barlucchi L,Torella D,et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration[J].Cell,2003,114(6):763-776.

6 Oh H,Bradfute SB,Gallardo TD,et al.Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing,differentiation,and fusion after infarction[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(21):12313-12318.

7 Bu L,Jiang X,Martin-Puig S,et al.Human ISL1heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages [J].Nature,2009,460(7251):113-117.

8 Matsuura K,Nagai T,Nishigaki N,et al.Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes[J].J Biol Chem,2004,279(12):11384-11391.

9 Rumyantsev PP.Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration [J].Int Rev Cytol,1977,51:187-273.

10 Wakitani S,Saito T,Caplan AI.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine[J].Muscle Nerve,1995,18(12):1417-1426.

11 Konieczny SF,Emerson CP Jr.5-Azacytidine induction of stable mesodermal stem cell lineages from 10T1/2 cells:evidence for regulatory genes controlling determination[J].Cell,1984,38(3):791-800.

12 冼绍祥,杨忠奇,汪朝晖,等.黄芪甲苷体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究[J].广州中医药大学学报,2007,24(1):37-41.

13 陈嘉,孙京臣.丹酚酸B诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J].第四军医大学学报,2007,28(23):2152-2155.