乳饮料中烟酸和烟酰胺的液相色谱检测方法

王春天，戴洋洋，闫磊，张延超，马文红，郑维君

（天津市乳品食品监测中心，天津 300381）

乳饮料中烟酸和烟酰胺的液相色谱检测方法

王春天，戴洋洋，闫磊，张延超，马文红，郑维君

（天津市乳品食品监测中心，天津 300381）

建立一种测定乳饮料中烟酸和烟酰胺含量的高效液相色谱法。样品经乙晴萃取后进样，采用C18100 mm×2.1 mm色谱柱分离，流动相为甲醇、异丙醇、庚烷磺酸钠。紫外检测；A-R261 nm，RSD为0.56%～0.82%（n=5），标准曲线r=0.9998，平均回收率分别为98.2%，烟酸最低检出限为6.25 μg/100 g，烟酰胺最低检出限为12.5 μg/100 g。

超高压液相色谱（UPLC）；烟酸；烟酰胺；乳饮料

烟酸又名尼古丁酸，俗名VB5，化学名为吡啶-3-甲酸。分子式C6H5NO2，分子量123.11，为白色针状结晶或粉末、熔点236℃～237℃,比重1.473。易溶于水、能溶于乙醇、氯仿和碱溶液，无臭、略带酸味。在空气中稳定，毒性微。

烟酰胺俗名VB3，又名尼克酰胺，化学名为3-吡啶甲酰胺，分子式C6H6N2O，分子量122.13，为白色针状结晶或粉末，熔点129℃～131℃，比重1.400。易溶于水、能溶于乙醇和甘油。无臭、略带苦味，微毒。

有专家把烟酸看作是具有生物活性的吡啶-3-羧酸及其衍生物的总称，烟酰胺是它在动物体内的作用存在形式，烟酸的活性结构简单，理化性质稳定，不易被酸、碱、热所破坏。预混料中的烟酸在5、25、35℃温度下存储24个月，保有率99%。因而被认为是最稳定的维生素[1]。

早在1926年I.Golddberger等发现VB5中含有预防和治疗糙皮病的因子，1937年C.A.Elvehijiem等分离出烟酸，不久又在肝脏中获得了烟酰胺。由于它们的生理作用相仿，故一起被命名为抗糙皮病维生素。烟酸和烟酰胺是B族维生素物质，主要存在于肾、肝、肌肉、乳汁、蛋黄、花生和水果中。

我国现有乳制品中烟酸、烟酰胺的检测方法只有针对于乳粉的相关检测，而对于乳饮料的适用性较差，本方法的研究目的是为了建立一种适用于乳饮料中烟酸、烟酰胺的检测方法，进一步完善了国家标准关于乳制品中烟酸、烟酰胺的检测方法[2]。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

1.1.1 试剂

甲醇、异丙醇、庚烷磺酸钠、乙腈、烟酸和烟酰胺（标准品，不少于99%），其余试剂为分析纯，水为去离子水。

1.1.2 测试样品

乳饮料。

1.2 仪器和设备

超高压液相色谱WATERS UPLC（带紫外检测器）；分析天平（0.0001 g）；滤膜（有机相，0.22 μm）。

1.3 方法提要及原理

样品经乙腈+去离子水萃取后，过滤出去蛋白质和脂肪后，离心，经超高压液相色谱仪测定，保留时间定性，峰面积定量。

1.4 测定步骤

1.4.1 提取

精确称取样品15.000 g放入100 mL容量瓶中。准确加入乙腈+去离子水（比例为30+70）定容到100 mL，剧烈振荡2 min后，静置30 min，取上清液于高速离心机中离心，取滤液适量用0.22 μm的有机滤膜过滤，滤液备用待测。

1.4.2 测定

分别取5 μL标准溶液和样品待测液注入高压液相色谱仪进行分析，得到组分的色谱峰。以保留时间定性，用组分的色谱峰峰面积定量。

1.4.2.1 仪器条件

色谱柱：C18柱，1.7 μm，2.1 mm×100 mm（或相当型号色谱柱）；

流动相：甲醇70mL，异丙醇20mL，庚烷磺酸钠1g,用910 mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经 0.22 μm 膜过滤[3]。

流速：0.4 mL/min；

紫外检测器波长：261 nm；

进样量：5 μL。

1.4.2.2 空白试验

除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

1.5 结果计算

试样中烟酸烟酰胺含量以X表示，单位为（μg/100 g）按式（1）计算。

式中：S为试样中烟酸烟酰胺的峰面积；S0为标准溶液中烟酸烟酰胺的峰面积；C0为标准溶液中烟酸烟酰胺的浓度，（μg/mL）；V 为样液最终定容体积，（mL）；m 为称样量，（g）。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

烟酸标准溶液浓度与峰面积响应值，见表1。

表1 烟酸标准溶液浓度与峰面积Table 1 Nicotinic acid concentration and peak area of standard solution

图1 烟酸在不同浓度标准溶液与峰面积的线性关系Fig.1 Nicotinic acid standard solution of different concentration and the linear relationship between peak area

烟酸在0～5 μg/mL范围内呈线性相关，相关系数为0.9999，回归方程为y=47943x-475.68。

表2 烟酰胺标准溶液浓度与峰面积Table 2 Nicotinamide concentration and peak area of standard solution

图2 烟酰胺在不同浓度标准溶液与峰面积的线性关系Fig.2 Nicotinamide standard solution of different concentration and the linear relationship between peak area

烟酰胺在0～5 μg/mL范围内呈线性相关，相关系数为0.9994回归方程为y=52614x+1932.6。

2.2 准确度和精密度

2.2.1 准确度

通过对乳饮料中样品在不同浓度水平上（0.3、5.00、10.0、30.0 mg/kg）加标，回收率最低为 91.98%，最高为108.4%。说明本方法测定乳制品中烟酸烟酰胺是具有较好准确度的，结果见表3。

表3 本方法测定加标样品的回收率Table 3 Determination of sample this method the recovery rate

烟酸回收率最低为91.98%，最高为102.0%，平均为97.18%。烟酰胺最低为93.21%，最高为108.4%，平均为97.32%。说明本方法测定乳制品中烟酸、烟酰胺具有较高的准确度。

2.2.2 精密度

经过对阳性样品的18次平行测定得到数据的统计计算，阳性样品（烟酸烟酰胺）结果的变异系数分别为1.9%、2.9%，证明方法精密度良好，达到测试要求水平。

乳饮料烟酸阳性样品结果的变异系数为2.9，烟酰胺阳性样品结果的变异系数为3.3，证明方法精密度良好，达到检测要求，结果见表4。

表4 本方法测定的阳性样品18次平行试验结果Table 4 The determination of positive sample 18times in parallel experimentsμg/100g

2.2.3 检出限

经测定烟酸方法检出限6.25 μg/100 g，烟酰胺的方法检出限 12.5 μg/100 g。

表5 烟酸的检出限Table 5 The detection limit of nicotinic acid

烟酸烟酰胺混合标准品谱图，分离效果非常好，结果见图3。

表6 烟酰胺的检出限Table 6 The detection limit of nicotinamide

图3 烟酸烟酰胺标准品谱图Fig.3 Nicotinic acid and nicotinamide standard spectrum

乳饮料中烟酰胺的谱图，分离效果好，而且目标峰附近没有杂峰，峰型也很好，见图4。

图4 乳饮料中烟酰胺的谱图Fig.4 Nicotinamide spectrum of dairy products

乳饮料中烟酸的谱图，分离效果好，而且目标峰附近没有杂峰，峰型也很好，见图5。

图5 乳饮料中烟酸的谱图Fig.5 Nicotinic acid spectrum of dairy products

样品中烟酸烟酰胺加标谱图，峰型很好，没有肩峰和拖尾现象，说明加标效果好，见图6。

3 结论

通过对多个批次不同品牌不同类型乳饮料的测定，测得其精密度与准确度均能达到要求，本方法对大多数乳饮料的烟酸、烟酰胺的测定均适用。

图6 样品中烟酸烟酰胺加标谱图Fig.6 Standard spectra of dairy products

[1]罗浇燕,周洪伟,林玉娜.快速测定食品中烟酰胺、维生素B1、B6含量[J].中国卫生检验杂志，2005(6)

[2]GBT 5009.197-2003保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定

[3]GB 5413.15-2010婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定

Dairy Products Nicotinic Acid and Nicotinamide Liquid Chromatography Detection Methods

WANG Chun-tian,DAI Yang-yang,YAN Lei,ZHANG Yan-chao,MA Wen-hong,ZHENG Wei-jun
（Dairy Food Monitoring Center，Tianjin 300381，China）

To establish a milk drink determination of nicotinic acid and nicotinamide by HPLC method.The sample was extracted with acetonitrile,C18100 mm×2.1 mm column with mobile phase of methanol,isopropanol,heptane sulfonate.UV detection;A-R261 nm,RSD is 0.56%-0.82%（n＝5）,the correlation coefficients were more than 0.9998,the recoveries were 98.2%.The detection limit of nicotinic acid was 6.25μg/100 g,the detection limit of Nicotinamide was 12.5μg/100 g.

high pressure liquid chromatography（Waters UPLC）;nicotinic acid;nicotinamide;milk drink

王春天（1975—），男（汉），助理工程师，专科，研究方向：乳制品和食品中营养成分，加工添加成分及农兽药残留的检测。

2010-09-01