广豆根不同溶剂提取物清除自由基活性研究

王凯，张业，义祥辉，刘贤贤,*，潘英明，黄丽娟，谭丁弦

（1.桂林师范高等专科学校化学与工程技术系，广西 桂林 541001；2.广西师范大学化学化工学院，广西 桂林 541004）

广豆根不同溶剂提取物清除自由基活性研究

王凯1，张业1，义祥辉1，刘贤贤1,*，潘英明2，黄丽娟1，谭丁弦1

（1.桂林师范高等专科学校化学与工程技术系，广西 桂林 541001；2.广西师范大学化学化工学院，广西 桂林 541004）

对广豆根水提取物（WE）、乙醇提取物（EE）、乙酸乙酯提取物（EAE）和丙酮提取物（AE），各提取物的总黄酮含量进行了测定，并研究了其DPPH自由基、ABTS自由基清除活性。结果表明，4种提取物总黄酮含量分别为49.81μg/mg（EE）、27.98μg/mg（WE）、67.7μg/mg（AE）、106.36μg/mg（EAE）。且各提取物均具有较强的自由基清除活性，其活性顺序为EE>EAE>AE>WE。除EE之外，WE、EAE与AE中总黄酮含量与其自由基清除活性成分存在一定的相关性。

广豆根；总黄酮含量；DPPH自由基；ABTS自由基

抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，不但能用于阻止或延缓油脂的自动氧化，防止食品在贮藏过程中因氧化而褐变、褪色、使营养损坏，同时还可以作为一类重要的生物活性物质，清除人体代谢过程中产生的自由基，具有延缓机体衰老的功效，从而成为新世纪以来研究的热点[1]。但研究表明，一些人工合成食品抗氧化剂如BHT和BHA具有一定的毒副作用，因此人们把抗氧化剂研究的重点转向了天然、低毒、高效的天然抗氧化剂[2-3]。而部分植物中所含有的活性成分具有羟基取代的高反应性和强的吞噬自由基能力，故其抗氧化性能非常卓越，从而被作为天然自由基清除剂的重要来源。

广豆根为豆科物柔枝槐（Sophora subprostrata Chun et T.Chen）的根，药用于治疗咽喉牙龈肿痛、肺热咳嗽烦渴、黄疸、热结便秘[4]，但其自由基清除活性国内外鲜见报道。为挖掘广豆根的潜在药用价值，对广豆根4种不同溶剂提取物总黄酮含量及其自由基清除活性进行了研究，并探讨了其总黄酮含量与自由基清除活性之间的关系，以期为广豆根的进一步开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器设备

广豆根购于桂林国药大药房，45℃烘干，粉碎后保存备用；二苯代苦味酰自由基（DPPH）、2，2’－连氮基－双－（3－乙基苯并二氢噻唑啉－6－磺酸）二铵盐（ABTS）：均购于美国SIGMA公司；其他试剂均为国产分析纯。

KQ2200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；DJ-02灵巧型粉碎机：上海淀久中药机械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 广豆根不同提取物的制备

将广豆根药材粗粉过筛（30目），随后称取药粉5 g分别用水、丙酮、乙酸乙酯、乙醇4种不同极性溶剂（50 mL）在室温下置于超声波提取设备中提取（30 min，功率90 W），重复3次，抽滤，合并滤液。合并液用旋转蒸发仪浓缩得到浸膏，计算产率，置冰箱备用。各提取物的产率分别为12.9%（EE）、11.7%（WE）、6.0%（AE）、4.0%（EAE）。

1.2.2 总黄酮含量测定

参照文献[5]法，将提取液（1 mL，0.1 mg/mL）溶解于5 mL蒸馏水，加入NaNO2水溶液（0.3 mL，5%）混合均匀后静置5 min，随后加入AlCl3（0.6 mL，10%），再静置5 min，最后加入NaOH水溶液（2 mL，1 mol/L），在510 nm之下测定吸光度。并以儿茶素为标样制作标准曲线，总黄酮含量以μg/mg表示。

1.2.3 DPPH自由基清除法

参照文献[5]法，分别移取上述不同浓度的广豆根样品溶液与DPPH溶液按一定比例混合均匀，在37℃水浴恒温30 min，随后在517 nm波长处测定其吸光度（Atest），并测定不加任何提取液的DPPH溶液的吸光度（Acontrol）。通过下面公式计算自由基清除率SC%：SC%=[（Acontrol-Atest）/Acontrol]×100%。并绘制广豆根各提取液浓度-SC%曲线。再通过线性拟合方程求样品对DPPH自由基清除的半抑制浓度值（IC50）。

1.2.4 ABTS自由基清除法

参照文献[5]法，首先用pH为7.4磷酸缓冲溶液配制ABTS标准液（50 mL，2 mmol/L），将此溶液与K2S2O8水溶液（200 mL，70 mmol/L）充分混合后再暗处放置15 h～16 h（过夜）。随后用蒸馏水调节ABTS·+溶液在734 nm的吸光度为0.700±0.030。移取不同浓度的样品溶液与ABTS·+溶液按照一定比例室温下混合，避光静置3 min后734 nm下测定其吸光度（Atest），并测定不加任何提取液的ABTS溶液的吸光度（Acontrol）。通过下列公式计算自由基清除率SC%：自由基清除率SC=[（Acontrol-Atest）/Acontrol]×100%。随后绘制广豆根提取液浓度-SC%曲线，再通过线性拟合方程求样品对ABTS自由基清除的半抑制浓度值（IC50）。

2 结果与分析

2.1 各提取物总黄酮含量

黄酮类物质是许多天然植物提取物的自由基清除剂活性成分，具有抗癌、护肝、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒等作用。本文采用儿茶素当量来表示各提取物中总黄酮含量。儿茶素总黄酮标准曲线如图1。

其线性回归方程为：

由此可求出广豆根各产物的总黄酮，表示为μg儿茶酚/mg干固体。各提取物总黄酮含量见表1。

表 1 各提取物总黄酮含量与自由基清除活性关系Table 1 Relationship between total flavonoid and free radical scavenging activity of extracts

其大小分别为49.81、27.98、67.7、106.36μg/mg，含量大小顺序关系为WE>EE>EAE>AE。

2.2 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基在有机醇溶剂中是一种很稳定的以氮为中心的自由基，DPPH含有一个单电子，在517 nm附近有强吸收（呈深紫色），当自由基清除剂存在时，单电子被配对，紫外吸收减弱或消失。因此通过测定紫外吸收减弱的程度，可评价该自由基清除剂的活性。由于DPPH自由基对受试物活性成分灵敏度较高，而且操作简单易行，这种方法得到了广泛的应用。通常用清除率表示清除能力。清除率越大，表明该物质对自由基的清除能力越强。广豆根各提取物对DPPH自由基的清除作用见图2。

由图2表明，广豆根的不同溶剂提取物对DPPH自由基均具有良好的清除能力，且清除率均随质量浓度增加而增大，说明不同广豆根提取物对DPPH自由基的清除能力与其浓度都存在明显的剂量效应关系。而不同的提取物对DPPH自由基的清除能力有一定的差异，相同浓度时，清除率从强到弱的顺序为EE>EAE>AE>WE。当提取物浓度为0.02 mg/mL时，4种提取物对DPPH自由基的清除率依次为89.83%、83.51%、81.39%、45.77%。

2.3 ABTS自由基清除活性

ABTS自由基清除法是根据ABTS与K2S2O8反应而生成ABTS·+，然后通过测定自由基体系在加入自由基清除剂之后的吸光度变化而评价对自由基清除剂的清除活性。广豆根各提取物对ABTS自由基的清除作用见图3。可知，通过对广豆根提取物的ABTS自由基清除试验，得知广豆根的不同溶剂提取物均对ABTS自由基都有良好的清除作用，清除率都随质量浓度增加而增加。但从总体上看不同溶剂的提取物对ABTS自由基的清除作用不尽相同，从强到弱的顺序与2.1中对DPPH自由基清除活性顺序一致，为EE>EAE>AE>WE。当提取液浓度为0.05 mg/mL时，各提取物对ABTS自由基的清楚率依次为90.17%、85.6%、77.61%、73.54%。

2.4 提取物自由基清除活性与其总黄酮含量关系

清除自由基一半浓度时所需自由基清除剂的浓度称为自由基清除的半抑制浓度即IC50值（The inhibitory concentration at which free radicals were scavenged by 50%），通常被用来评价化合物对自由基的清除能力的大小。IC50值越低，说明自由基清除剂对自由基的清除能力越强。广豆根的不同溶剂提取溶液对DPPH与ABTS自由基的 IC50见表1。可知，从IC50值可以看出，除EE之外，WE、EAE与AE自由基清除活性随总黄酮含量而递增，由此可推测WE、EAE与AE自由基清除活性成分与其总黄酮含量存在一定的关系，而EE中黄酮与其自由基清除活性关系不大。

3 结论

广豆根的不同溶剂提取物均具有较强的自由基清除能力。不同溶剂提取物的自由基清除活性强弱顺序为：EE>EAE>AE>WE。即在相同质量浓度下，EE的清除活性最强，EAE和EE次之，WE最弱。WE、EAE与AE抗氧化活性与其总黄酮含量存在一定的关系，而EE所含主要的抗氧化活性成分可能还有其他多酚类物质。总之，广豆根作为一种华南地区常见中药，其提取物均不失为良好的天然无毒的绿色自由基清除剂，具有作为自由基清除剂开发和利用的价值。如果将其进行进一步的分离纯化，从中筛选出具有自由基清除活性的单体化合物，这无疑将更具研究价值与开发前景。

[1]Pan Y M,Zhu J C,Wang H S.et al.Antioxidant activity of ethanolic extract of Cortexfraxini and use in peanut oil[J].Food chemistry,2007,103(3):913-918

[2]熊皓平，杨伟丽，张友胜，等.天然植物抗氧化剂的研究进展[J].天然产物研究与开发，2001，13(5)：75-79

[3]潘英明，梁英，朱志仁，等.槐花米抗氧化成分的提取及其活性研究[J].林产化学与工业，2007，27(2)：41-44

[4]江苏新医学院.中药大辞典：上册[M].上海：上海科学技术出版社，1986：1319

[5]Wang K,Pan Y M,Wang H S.et al.Antioxidant activities of Liquidambar formosana Hance leaf extracts[J].Medicinal chemistry research,2010,19:166-176

Study on Free Radical Scavenging Activity of Different Solvents Extracts from the Root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen

WANG Kai1，ZHANG Ye1，YI Xiang－hui1，LIU Xian－xian1，*，PAN Ying－ming2，HUANG Li－juan1，TAN Ding－xian1
（1.Department of Chemistry and Engineering Technology，Guilin Normal College，Guilin 541001，Guangxi，China；2.College of Chemistry ＆ Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China）

The total avonoids content of water extract（WE），ethanol extract（EE），ethyl acetate extract（EAE）and acetone extract（AE）of the root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen were measured as well as their DPPH free radical and ABTS free racdical scavenging activity were determined.The results indicated that the total avonoids conten of extracts were 49.81μg/mg（EE），27.98μg/mg（WE），67.7μg/mg（AE），106.36μg/mg（EAE）.And all extracts showed strong free radical scavenging activity with the orders were：EE＞EAE＞AE＞WE.There is a relationship between the radical scavenging activity and total avonoids content of all extracts except EE.

the root of Sophora subprostrata Chun et T.Chen；total avonoids content；DPPH free radical；ABTS radical

广西青年基金（0832024）；广西医药产业人才小高地项目（0808）；广西区教育厅科研项目（No.200911MS281、No.200911MS 282）

王凯（1984—），男（汉），硕士，研究方向：天然产物提取分离与活性筛选。

*通信作者

2011-03-14