Robo家族在肝癌细胞系的表达

吴明松，路健，汤贤春

（遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，贵州遵义563003）

Robo(Roundabout)家族包括：Robo1,2,3，4 等4个成员，是一类高度保守的跨膜蛋白，在神经系统的发育中发挥导向因子作用。其Robo1,2,3主要表达于神经系统，对神经轴突延伸和神经细胞迁移有重要的调控作用。Robo4特异表达于血管生成活跃的内皮细胞表面，对内皮细胞的迁移有一定的抑制作用[1-2]。近来的研究表明，Robo家族在肿瘤中的作用也备受关注，其原因是与肿瘤的浸润转移有关[4,6,7]。但是，Robo家族在不同肝癌细胞中的表达情况不清楚。本文用RT-PCR的方法研究Robo1，Robo2、Robo3和Robo4在8个肝癌细胞系的表达。

1 材料和方法

1.1 材料 CMMC7721（简称为 7721）、Hep3B、97L、PLC、P1、M3、Huh7、Hep G2（简称为G2）购自上海细胞库。

1.2 仪器与试剂CO2孵箱美国SHELLAB公司（型号：TC2323-2E），PCR仪：Bio-Rad公司。1640培养基：Gibco公司产品；胎牛血清，美国Corning公司产品；胰酶，北京华美生物公司产品。逆转录酶：Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养1640培养基（含L-谷氨酸），胎牛血清 10%（V/V），青/链霉素 100 IU/ml。细胞在 37℃5%的CO2孵箱中培养。

1.3.2总RNA提取采用Trizol试剂抽提细胞中总RNA，操作按照试剂盒说明书要求进行。抽提后用紫外分光光度计定量和鉴定其纯度,总RNA符合纯度要求(1.8

1.3.3 RT-PCR 采用反转录试剂盒合成c DNA，逆转录(RT)的反应体系包括1g RNA、5×RT缓冲液、1 mmol/L d NTP mix、0.5l RNase抑制剂、1l RTase、1.5l引物，加DEPC水补足至20l，反应步骤为42℃反应1 h,70℃孵育10 min。 PCR反应条件：95℃预变性3 min，94℃30 s，55.9℃ 60 s，共35个循环，然后72℃ 5 min。取PCR产物各5l于2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 各基因的引物序列

2 结果

图1 ：Robo家族在8种肝癌细胞系中的表达

由图1可见，Robo1在7721、Hep3B、PLC、P1、M3、Huh7细胞系表达量较高，而在97L和G2细胞系表达量较低。Robo2只在PLC细胞系中微量表达。Robo3在Hep3B、Huh7表达较高，而97L和G2表达较低，其它细胞系均无表达。Robo4在这8个细胞系均表达，除了97L和P1表达较低外，其它细胞系表达都很高。

3 讨论

基因的表达模式改变与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤中特异表达的基因也是新型抗肿瘤药物研发的靶点。目前Slit/Robo信号在肿瘤中的作用并没有完全确定，在肿瘤发生发展中的作用存在相互矛盾的研究结果[3,4]。因此，弄清楚Slit/Robo信号介导的信号通路对于以此信号为靶点治疗肿瘤提供重要的理论依据[5,6]，不仅将成为肿瘤辅助诊断和治疗研究的另一个焦点，也将为肿瘤的药物治疗提供一个新的作用靶点[7]。本研究显示，Robo1和Robo2在这8个肝癌细胞系中表达水平是一致的，而Robo3和Robo4的表达则有细胞系的差异，这说明了不同个体同一疾病的遗传学背景可能有很大差异，也解释了不同病人对于同种药物的敏感性差异的现象。体外细胞培养实验在癌症研究中占有重要地位，本研究也说明了一个问题，就是要研究某一基因的功能，要选择适当的细胞系，否则，会事半功倍，甚至得出错误的结论。

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