功能因子角鲨烯胞内抗氧化作用的研究

乔镜澄，张同存，姜悦，路福平

（1.天津天狮学院 生物工程学院，天津 301700；2.天津科技大学 生物工程学院，天津 300222）

基于对细胞体外受氧胁迫的抗氧化的反应的研究，已发现氧自由基可以导致细胞结构和功能的损伤，最终导致细胞的死亡。其中脂质过氧化就是氧胁迫的产物。然而，在细胞内的抗氧化作用的反应机理仍不清楚[1]。

破囊壶菌的重要合成产物角鲨烯，角鲨烯（squalene）[2-3]：化学命名为2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22.二十四碳六烯，是一种长链三萜类化合物，别名为鲨烯、三十碳六烯、角鲛油素或鱼肝油萜，属于不饱和脂质，它是所有类固醇合成的前体物质。鲨烯是天然抗氧化剂，可以保护细胞免遭自由基的损害并且可以增强细胞的免疫系统。鲨烯的特殊性质使其应用范围非常广泛，这种无毒性的物质可以直接添加到普通食品中，添加鲨烯和不饱和脂肪酸的功能性食品也在积极的研制中。

已有研究报道[4]，在细胞外部鲨烯可以防止不饱和脂肪酸的过氧化反应。然而，在细胞内的抗氧化作用的机制仍然不清楚。已有报道[1]双氧水是细胞内脂肪酸过氧化反应的主要诱导剂，Cumeme hydroperoxide（CHP）t-Butylhydroperoxide可以引发小鼠肝细胞内的脂肪酸产生过氧化现象，茉莉酸甲酯也是常用的引起脂肪酸过氧化现象的诱导剂[5]。

本研究选用上述4种常用的脂质过氧化诱导剂作用于破囊壶菌引发细胞内脂质过氧化反应。通过测定MDA的含量反映细胞内脂质过氧化的程度，也间接反映出细胞受到ROS攻击后的损伤程度[6]，因此在本实验中选用这一指标，观察细胞内在外界氧胁迫下抗氧化的反应。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

破囊壶菌（Thraustochytrid）Aurantiochytriumsp.BRMP4-A1，香港浸会大学理学院生物系微藻研究实验室提供。

1.1.2 培养基

培养基组成（1 L）[7]：MnCl28.6 mg/L，FeCl32.9 mg/L，ZnCl20.6 mg/L，CoCl2·6H2O 0.28 mg/L，CuSO4·5H2O 0.02 mg/L，硼酸 34.2 mg/L，Na2EDTA 30 mg/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KCl 1 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO40.3g/L，NaHCO31g/L，葡萄糖30g/L，NaCl 25g/L，谷氨酸钠 2 g/L，Yeast Extract 2 g/L，蒸馏水定容至1 L。

配制好后，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节pH为6.0，然后高压蒸汽灭菌，灭菌条件为：121℃，20min。

1.1.3 试剂

双氧水，t-Butyl htdroperoxid：美国sigma公司，茉莉酸甲酯：美国sigma公司，Cumeme hydroperoxide：美国sigma公司，其他试剂为化学纯或分析纯。

1.1.4 仪器和设备

HS-200B恒温培养摇床：上海和呈仪器制造有限公司；HV-50高压灭菌锅：日本TOMY公司；JY98-III超声波间歇破碎仪：宁波新芝仪器研究所；VLT1386-3-V34超低温冰箱：美国REVCO公司；Allegra X-22台式高速离心机：美国贝克曼。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养

菌种培养：挑取一环接种到装有100 mL液体种子培养基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒温，黑暗条件下培养48 h。

菌体发酵：以5%的接种量接种种子液到装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒温，黑暗条件下培养36 h。

1.2.2 样品中丙二醛浓度的测定

按照丙二醛测定试剂盒操作步骤进行加样。旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，然后3500 r/min～4000 r/min，离心10 min，取上清在OD532nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测定样品的吸光度值。

1.2.3 细胞存活率测定方法

稀释平板计数法：菌液混合均匀后，无菌条件下，吸取1 mL菌液，移入装有9 mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，进行10倍系列梯度稀释，吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液500 mL到无菌培养皿中，再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，将涂布好的平板平放于桌上20 min～30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，室温黑暗培养，至长出单菌落后即可计数。

1.2.4 菌体干重测定方法

将GC-50滤纸105℃烘干，放入干燥箱中冷却至重量恒定，称重备用。在通风橱中用移液管吸取5 mL菌液，抽滤到已烘干的滤纸上，105℃烘干，隔夜，冷却后称其重量。根据2个重量差及菌体量计算菌体干重。

2 结果与讨论

2.1 双氧水诱导的脂过氧化反应

细胞培养到36 h时，加入双氧水，继续培养4 h，测定细胞内MDA含量，结果如表1所示。

表1 36 h时双氧水对细胞生长的影响和脂过氧化作用Table 1 Effect of H2O2on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 36 h

在菌体细胞发酵培养0 h时，加入双氧水，继续培养36 h，收集细胞，测定细胞内MDA值，细胞干重及细胞存活率，结果如表2所示。

表2 0 h时加入双氧水对细胞干重的影响和脂过氧化作用Table 2 Effects of H2O2on cell dry weight（DW），cell number and MDA value at 0 h

由表1、表2所示，36 h时加入脂质过氧化诱导剂，随着双氧水浓度的增加MDA值呈现下降趋势，当双氧水终浓度达到当5000 μmol/L时，MDA值明显低于空白对照组。同时，细胞存活率随着双氧水的浓度增加而降低。双氧水浓度达到1000 μmol/L和5000 μmol/L时，细胞数仅为104个/mL。在细胞培养0 h时，加入双氧水，MDA值仍然没有明显上升，只有在双氧水浓度为500 μmol/L时，MDA值接近空白对照组。而随着双氧水浓度的增加，细胞干重与细胞数都呈现下降趋势，即细胞存活率随着双氧水浓度的增加而降低。

2.2 t-butyl hydroperoxide诱发的脂过氧化反应

将t-butyl hydroperoxide加入到培养36 h的细胞进行诱导脂质过氧化的实验，继续培养4 h，测定细胞内MDA含量，结果如表3所示。

表 3 36 h 时加入 t－butyl hydroperoxide（t－BuOOH）对细胞存活的影响和脂质过氧化作用Table 3 Effect of t-butyl hydroperoxide（t－BuOOH）on cell viability and MDA value at 36 h

在菌体细胞发酵培养0 h时，加入t-Butyl hydroperoxide，继续培养至36 h，收集细胞，测定细胞内MDA值，细胞干重及细胞存活率，结果如表4所示。

表4 0 h时加入t-Butyl hydroperoxide对细胞生长的影响和脂过氧化作用Table 4 Effects of t-Butyl hydroperoxide on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 0 h

由表3、表4所示，36 h时加入脂质过氧化诱导剂MDA值没有随着t-Butyl hydroperoxide浓度的增加而提高，相反呈现下降趋势，并且均明显低于空白对照组，而通过平板计数可知，高浓度的t-Butyl hydroperoxide对细胞作用较大，当其浓度达到1000 μmol/L时，细胞数为零，细胞生长完全被抑制。细胞培养0 h时，加入脂质过氧化诱导剂，t-Butyl hydroperoxide在较高浓度下，细胞存活率很低，甚至死亡，0 h时，细胞内抗氧化物质积累量较少，因此在高浓度的t-Butyl hydroperoxide作用下，对细胞造成毒害作用，导致细胞死亡。加入这种脂过氧化诱导剂后，MDA值没有上升，均明显低于空白对照组。

2.3 茉莉酮酸甲酯诱导的脂过氧化反应

将茉莉酮酸甲酯加入到培养36 h的细胞中，进行脂质过氧化诱导，继续培养4 h，测定细胞内MDA含量，结果如表5所示。

表5 36 h时加入茉莉酮酸甲酯对细胞生长的影响和脂过氧化作用Table 5 Effects of Methyl jasmonate on cell growth and MDA value at 36 h

由表5所示，在各浓度茉莉酸甲酯的作用下，MDA值都低于空白对照组，茉莉酮酸甲酯对细胞的生长并没有抑制作用，细胞数没有影响。

2.4 cumeme hydroperoxide（CHP）诱导的脂过氧化反应

将培养到36 h的细胞加入CHP进行脂质过氧化诱导，继续培养4 h，测定细胞内MDA含量及细胞数，结果如表6所示。

由表6所示，只有当cumeme hydroperoxide浓度达到100 μmol/L 时，MDA值略高于空白对照（527.1）为562.5，在所选用的CHP的浓度范围内，细胞的生长并没有受到抑制，由此可以得出，CHP对于细胞的生长没有毒害作用。

表6 36 h时加入cumeme hydroperoxide对细胞生长的影响和脂质过氧化作用Table 6 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 36 h

在菌体细胞发酵培养0 h时，加入cumeme hydroperoxide，继续培养36 h，收集细胞，测定细胞内MDA值，细胞干重及细胞存活率，结果如表7所示。

表7 0 h时加入cumeme hydroperoxide对细胞生长和脂过氧化作用Table 7 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 0 h

由表7所示，高浓度的CHP仍然未能诱导脂过氧化反应，MDA值均明显低于空白对照组，但是在较高浓度CHP作用下，细胞数下降，细胞存活率降低。

3 结论

本研究选用H2O2、t-Butyl hydroperoxide、茉莉酸酮甲酯和CHP 4种常用的脂质过氧化诱导剂处理BRMP4-A1菌株细胞[8-10]，并考察细胞脂质过氧化反应程度，结果表明：在整个实验过程中，都没有看到MDA值的明显升高。同时，已有研究证明[7]，该菌株在细胞培养至36 h时，细胞内积累鲨烯量达到最大值，因此，认为正是破囊壶菌合成的鲨烯可以保护不饱和脂肪酸发生自发氧化现象，它较强的抗氧化作用可以减少自由基的生成，而鲨烯本身清除了氧自由基，在这样的多重作用下，强有力的遏制了过氧化物造成的细胞内部的脂质过氧化的损失，也抑制了脂质过氧化。所以本实验可以看到MDA的含量均明显低于空白对照组。当CHP浓度达到100 μmol/L时，MDA值高于空白对照，引发细胞内的脂过氧化，而细胞存活率未受到影响，这种情况表明，很大可能是鲨烯的抗氧化性保护细胞免受自由基的侵害，减小了细胞受损伤程度，这也仍需进一步的验证。

当细胞培养0 h时，未出现MDA高于空白对照组想象，但是在高浓度的诱导剂作用下，细胞出现了死亡，这一结果表明：0 h时，细胞内代谢物的积累为0，高浓度的氧化剂t-Butyl hydroperoxide在发酵初期就导致细胞的大量死亡，不能合成鲨烯。因此，得出t-Butyl hydroperoxide对破囊壶菌细胞有毒害作用，高浓度作用下会导致破囊壶菌的死亡[11]。随着作用时间的增加，在破囊壶菌细胞内部，鲨烯逐渐积累，低浓度的t-Butyl hydroperoxide和茉莉酮酸甲酯没有诱导脂过氧化，所以脂过氧化并不是导致破囊壶菌细胞死亡的主要原因。细胞死亡是由于高浓度的t-Butyl hydroperoxide作用下而导致的。

可以确定在破囊壶菌的代谢产物中的确存在具有抗氧化作用的物质，并且角鲨烯在细胞内部已发挥作用能够抵抗脂质过氧化并且保护细胞免受外界侵害。

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