碱预处理秸秆同步糖化发酵生产丁二酸*

孔德城，郑璞，董晋军，倪晔，孙志浩

(工业生物技术教育部重点实验室;江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

碱预处理秸秆同步糖化发酵生产丁二酸*

孔德城，郑璞，董晋军，倪晔，孙志浩

(工业生物技术教育部重点实验室;江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

研究了碱预处理秸秆及用琥珀酸放线杆菌Actinobacillus sucinogenes同步糖化发酵秸秆生产丁二酸。结果表明:用1.0%NaOH溶液于120℃分别预处理玉米、小麦和水稻3种秸秆2 h，其木质素的脱除率、纤维素与半纤维素的总保留率均在85%以上。以3种碱预处理后的秸秆为原料，在补加纤维素酶与纤维二糖酶的条件下，A.sucinogenes F3-21摇瓶厌氧发酵72 h，产丁二酸浓度分别为30.74 g/L、24.98 g/L和26.57 g/L;在7 L罐中厌氧发酵72 h，丁二酸浓度分别达到40.21 g/L，30.06 g/L和39.07 g/L，每克预处理秸秆产丁二酸分别为0.50 g、0.38 g和0.49 g。并用钙盐法对玉米秸秆同步糖化发酵液进行提取，得到纯度为99.98%的丁二酸结晶。说明了玉米、小麦和水稻3种秸杆为原料进行同步糖化发酵生产丁二酸的可行性。

秸秆，丁二酸，同步糖化发酵，琥珀酸放线杆菌，提取酵产丁二酸的可行性，为农作物秸秆的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes F3－21)，本实验室保藏［6］;里氏木霉(Trichoderma reesei SW09－1)，本实验室保存菌种。

1.1.2 原料

玉米秸秆(产地河北)，水稻秸秆(产地常州)，小麦秸秆(产地常州)，风干粉碎成40目，烘干备用。

1.1.3 培养基

活化培养基(g/L):TSB 25。

种子培养基(g/L):葡萄糖10，酵母膏 5，玉米浆5，NaH2PO4·2H2O 9.6，K2HPO4· 3H2O 20.3，灭菌后加入膜滤NaHCO3。

同步糖化发酵培养基按文献［7］配制。

1.1.4 试剂和仪器

纤维素酶按文献［8］的方法生产;黑曲霉纤维二糖酶购自Sigma公司;其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。

7 L搅拌式发酵罐:BIOFLO 110，美国New Brunswick Scientific公司产品;高效液相色谱仪:Waters;RI检测器:Waters;Aminex HPX－87H离子色谱柱:300 mm ×7.8 mm，9μm，Bio－ Rad;FT-IR SPECTROMETER:Thermo。

1.2 方法

随着石油、煤炭等不可再生资源的日益减少，将农作物秸秆转化为生物质材料，并替代逐渐减少的石油基材料备受关注。丁二酸(又称琥珀酸)主要应用于化工、食品和医药等领域，是重要的C4平台化合物，12种优先发展的化学品之一［1］。目前商业化产品主要从石化原料马来酸酐催化还原制备，以农作物秸秆等纤维素为原料通过微生物发酵生产丁二酸，可以使丁二酸的制备摆脱对石化原料和粮食原料的依赖。2004年韩国的Kim等［2］报道了用木质素纤维原料生产丁二酸的研究，用木材水解液为原料发酵可积累11.7 g/L丁二酸;南京工业大学姜珉等［3］以酸水解的玉米皮纤维为原料，微生物发酵产丁二酸浓度35.8 g/L;合肥工业大学李兴江等［4］采用碱解和酶解处理秸秆水解液为原料，通过对金属离子和维生素的浓度、CO2和H2的比例，以及加入氟乙酸浓度的响应面试验，丁二酸产量提高约25%。本实验室［5］以玉米秸秆水解液为原料，在5L发酵罐上采用补料分批发酵，丁二酸浓度为53.2 g/L，生产强度1.21 g/(L·h)。上述报道均是以秸秆或木材的水解液为原料，先用纤维素酶水解制备还原糖，再以其为原料进行发酵，发酵过程受到水解原料来源的制约，需要水解设备的投入。

本实验以玉米、小麦和水稻秸杆3种秸秆为原料，通过考察碱预处理及其同步糖化发酵(SSF)发酵生产丁二酸和产物提取的情况，探讨秸秆同步糖化发

1.2.1 秸秆预处理的预处理

取一定量烘干粉碎后的秸秆，按固液比1∶15(g∶mL)的比例加入不同浓度的NaOH溶液，于120℃下处理2 h，抽滤得残渣，水洗至中性，烘干后粉碎至40目备用。

1.2.2 发酵方法

A.sucinogenes F3－21种子按10%接种量接入装有50 mL同步糖化发酵培养基的摇瓶中，加入纤维素酶和纤维二糖酶，通入100%CO2，37℃静置培养。纤维素酶与纤维二糖酶的添加量分别按每克预处理秸杆加入纤维素酶20 FPU和纤维二糖酶10 CBU［9］。

7 L发酵罐上中装同步糖化发酵培养基3 L，灭菌后，接入A.sucinogenes F3-21种子，并同时加入纤维素酶和纤维二糖酶，温度37℃，发酵前通入100%CO2，转速200 r/min，发酵过程中用MgCO3调节pH。

1.2.3 丁二酸提取方法［10］

发酵液煮沸5 min后，离心得到清液，清液经CaCl2溶液钙化、H2SO4酸解与活性炭脱色、过732阳离子交换树脂与阴离子交换树脂后，75℃下真空旋转蒸发浓缩，冷却结晶。流程如图1所示。

图1 钙盐法提取发酵液中丁二酸的工艺流程图

1.2.4 分析方法

(1)还原糖的测定［11］:采用 DNS 法。

(2) 秸秆成分的测定［12］:采用 Van Soest测定法。

(3)纤维素酶活和纤维二糖酶活的测定［13］:纤维素酶活按照滤纸酶活测定，纤维二糖酶活按照文献测定。

(4)有机酸测定:采用离子排斥HPLC法分析葡萄糖及丁二酸、乙酸、乳酸和甲酸等发酵产物［14］。美国Waters高效液相色谱仪，Waters 2414 RI检测器，Breeze色谱工作站;Aminex HPX－87H离子色谱柱(300 mm ×7.8 mm，9 μm;美国 Bio－Rad);流动相5 mmol/L H2SO4;柱温55℃;流速0.5 mL/min;进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 玉米、小麦和水稻3种秸秆主要成分比较

作物秸秆分布广泛，种类繁多，虽然因产地和品种不同。秸秆的物质组成和理化性质等存在差异，但秸秆在成分组成上主要是糖类，且以纤维素、半纤维素和木质素为主，其中C、H、O的总含量达70% ～90%，同时含有一定量的粗蛋白、粗脂肪和氮、磷、钾、钙等矿物质［15］。

从表1可知，实验用玉米、小麦和水稻秸秆中纤维素和半纤维素的总含量分别是61.52%、59.87%和56.18%，其中玉米秸秆的含量最高。3种秸秆木质素的含量，以小麦秸秆为最高，水稻秸秆次之，玉米秸秆最低。3种秸秆灰分的含量相差不大，约为5%。

表1 3种秸秆的主要化学成分

2.2 不同浓度NaOH预处理对3种秸秆成分的影响

从图2～图4可以看出，随着NaOH溶液浓度的增加，玉米、小麦和水稻秸秆的重量逐步减少，木质素脱除率逐渐增加，纤维素与半纤维素的含量也相应略有减少。用1.0%的NaOH与5%的NaOH溶液预处理秸秆时，玉米秸秆的木质素的脱除率92.4%和96.8%，纤维素和半纤维素的总含量分别是87.7%与88.8%;小麦秸秆的木质素脱除率分别为84.6%和92.6%，纤维素和半纤维素总含量分别是87.8%和87.4%;而水稻秸秆的木质素的除率分别是86.5%和93.4%，纤维素和半纤维素的总含量是82.8%和82.3%。说明1.0%与5.0%浓度的NaOH溶液预处理秸秆，3种秸秆中纤维含量的保留率与木质素脱除率都达到85%以上。考虑到处理后秸秆的洗涤水用量，选择1.0%NaOH溶液预处理。

用1%NaOH溶液预处理后的，玉米、小麦和水稻秸秆，其木质素含量分别为 1.08%、4.21%和3.68%，含量明显低于预处理前的含量。

2.3 三种预处理秸秆原料摇瓶发酵产丁二酸

3种预处理秸秆摇瓶发酵产酸的情况如表2所示，玉米秸秆产丁二酸最高，其次是水稻秸秆，小麦秸秆最低。三者副主要的产物都是乙酸，且浓度接近。预处理玉米秸秆和小麦秸杆中的纤维素和半纤维素的总含量都是87%，但两者的丁二酸浓度差别较大，其原因可能是预处理玉米秸秆中木质素含量较小麦与水稻的低。但玉米秸秆发酵后的残糖较小麦和水稻秸秆的明显较高，说明其摇瓶发酵没有完全。

表2 三种秸秆原料摇瓶同步糖化发酵结果

图2 不同NaOH浓度预处理对玉米秸秆主成分含量的影响

图3 不同NaOH浓度预处理对小麦秸秆主成分含量的影响

图4 不同NaOH浓度预处理对水稻秸秆主成分含量的影响

2.4 三种预处理秸秆在7 L发酵罐上发酵产酸比较

进一步在7 L发酵罐上考察3种预处理秸秆同步糖化发酵的产酸过程，如图5～图7。由图可以看出，3种秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的过程相似，主要副产物是乙酸、甲酸和乳酸，其中乙酸的浓度较高。其发酵过程中还原糖变化趋势为:发酵4 h左右，还原糖浓度积累达到最大，同时A.succinogenes F3-21结束调整期，随着 A.sucinogenes F3-21的生长，秸秆水解产生的还原糖快速被菌体利用，发酵液中还原糖的浓度维持在1.0～3.0 g/L。7 L发酵罐上，还原糖的利用比其在摇瓶中的利用好，其原因是发酵罐中存在搅拌，传质效果好。3种秸秆在发酵前50 h左右时，产丁二酸的速率都较快，随后产酸速率下降，发酵72 h，丁二酸浓度分别为40.21 g/L、30.06 g/L和39.07 g/L。与摇瓶 SSF相比，分别提高了30.85%、20.34%和47.05%。并且，玉米秸秆的产酸速率相对较高，水稻秸秆次之，小麦秸秆在其整个发酵过程中，产酸速率较低且平缓。3种秸杆产酸速率的不同可能与其在成分上的差异有关。

比较3种秸秆原料SSF产丁二酸的发酵特征，如表3，玉米秸秆在发酵过程中，其还原糖的维持浓度稍高于其他2种秸秆，这样使得玉米秸秆在SSF过程中，A.succinogenes F3-21能够利用的还原糖较多，其生产强度和丁二酸的产量也最高，其次是水稻和小麦秸秆。同时，丁二酸产量的高低与预处理秸秆的成分有关，在7 L发酵罐上产酸情况与摇瓶发酵结果相似，预处理后玉米秸秆的纤维素和半纤维素含量相对较高，木质素含量相对低，故其产酸浓度最高，预处理小麦秸秆中的木质素含量相对较高，产酸最低。

图5 7 L发酵罐中预处理玉米秸秆同步糖化发酵过程曲线

图6 7 L发酵罐中预处小麦秸秆同步糖化发酵过程曲线

图7 7 L发酵罐水稻秸秆同步糖化发酵过程曲线

表3 三种秸秆原料SSF产丁二酸特性比较

2.5 钙盐法提取丁二酸

以玉米秸秆发酵液为例，钙盐法提取丁二酸。200 mL发酵液一次结晶得到4.63 g丁二酸结晶，HPLC测定纯度为99.98%。其中各步提取的收率如表4，操作损失主要在钙化这一步，损失率约为15.19%，其余步骤丁二酸的损失相对较小。

表4 钙盐法提取丁二酸收率计算表

3 结论

(1)以不同浓度NaOH预处理玉米、小麦和水稻秸秆，1.0%NaOH溶液预处理能够较好地脱除秸秆中的木质素，并保留纤维素和半纤维素。

(2)比较3种预处理秸秆在摇瓶和发酵罐上SSF生产丁二酸，玉米秸秆产量最高，其次是水稻，小麦。其中在7 L发酵罐上产丁二酸浓度分别达到40.21 g/L，30.06 g/L 和 39.07 g/L，说明玉米、小麦和水稻3种秸杆都能作为微生物发酵生产丁二酸的原料，其中玉米秸秆的产丁二酸效率最高，每克预处理秸秆可产丁二酸0.50 g。

(3)用钙盐法提取玉米秸秆SSF发酵液中的丁二酸，得到纯度为99.98%的丁二酸晶体，结晶前收率为77.22%，反映了秸秆进行同步糖化发酵生产丁二酸的可行性。

［1］ Li Q，Yang M，Wang D，et al.Efficient conversion of crop stalk wastes into succinic acid production by Actinobacillus succinogenes［J］.Bioresource Technology，2010，101(9):3 292－3 294.

［2］ Kim D Y，Yim S C，Lee P C，et al.Batch and continuous fermentation ofsuccinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E［J］.Enzyme and Microbial Technology，2004，35(6 －7):648 －653.

［3］ 姜岷，姚嘉吴，吴昊，等.稀酸水解玉米皮制备丁二酸发酵糖液的研究［J］.食品与发酵工业，2007，33(10):6－10.

［4］ 李兴江，罗水忠，姜绍通，等.农作物秸秆发酵制备丁二酸的代谢工艺优化［J］.农业工程学报，2008，24(12):161－167.

［5］ Zheng P，Dong J J，Sun Z H，et al.Fermentative production of succinic acid from straw hydrolysate by Actinobacillus succinogenes［J］.Bioresource Technology，2009，100(8):2 425－2 429.

［6］ 刘璇，郑璞，倪晔，等.基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌［J］.微生物学通报，2009，36(11):1 676－1 681.

［7］ Zheng P，Fang L，Xu Y，et al.Succinic acid production from corn stover by simultaneous saccharification and fermentation using Actinobacillus succinogenes［J］.Bioresource Technology，2010，11(101)，7889 －7894.

［8］ 余晓斌，具润漠.里氏木霉液体发酵法生产纤维素酶［J］.食品与发酵工业，1998，24(1):20 －25.

［9］ 方林.玉米秸秆原料发酵生产丁二酸工艺研究［D］.无锡:江南大学，2009.

［10］ 金其荣，张继民，徐勤.有机酸发酵工艺学［M］.北京:中国轻工业出版社，1994:212－286.

［11］ Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid regent for determination of reducingsugar［J］.Analytical Chemistry，1959，31(3):426－428.

［12］ Van Soest P J，Rovertson J B，Lewis B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(10):3 83 －3 97.

［13］ Ghose T K.Measurement of cellulose activities［J］.Pure Appl Chem，1987，59(2):257－268.

［14］ 刘宇鹏，郑璞，孙志浩.采用离子排斥色谱法分析发酵液中的琥珀酸等代谢产物［J］.食品与发酵工业，2006，32(12):119 －122.

［15］ 胡俊梅.农作物秸秆资源化利用分析［J］.广东农业科学，2010，37(4):207－210.

Succinic Acid Production from Alkali Pretreated Stalk by Simultaneous Saccharification and Fermentation

Kong De-cheng，Zheng Pu，Dong Jin-jun，Ni Ye，Sun Zhi-hao
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

In this paper，alkali pretreatment of corn，wheat and rice three stalks，as well as succinc acid(SA)production by simultaneous saccharification and fermentation(SSF)from the pretreated stalks were investigated.Results showed that when corn，wheat and rice stalks were pretreated with 1.0%NaOH concentration at 120℃ for 2 h，the rates of both lignin removal and cellulose-hemicellulose remains were more than 85%.In the conditions of cellulose and cellobiase added，30.74 g/L，24.98 g/L and 26.57 g/L SA were achieved using the corn，wheat and rice pretreated stalks as stuff respectively，when SSF were performed 72 h by Actinobacillus sucinogenes F3－21 in 150 mL flask.While in a 7 L stirred bioreactor，SA concentration were obtained 40.21 g/L，30.06 g/L and 39.07 g/L in 72 h，and its yields of each per gram of pretreated stalks reached 0.50 g，0.38 g and 0.49 g correspondingly.Moreover the extraction of SA by precipitation from the broth of corn stalk SSF was attempted.SA crystal with a purity of 99.89%was obtained.The results suggest the feasibility of SA production by SSF from corn，wheat and rice stalks.

stalk，succinc acid，saccharification and fermentation(SSF)，Actinobacillus sucinogenes，extraction

硕士研究生(郑璞教授为通讯作者)。

*本课题受国家863项目支持(2006AA027235)

2011－05－17，改回日期:2011－06－25