以ORAC法为评价指标优化制备大豆抗氧化肽*

曹亚兰，赵谋明，郑赛晶，任娇艳

1(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510640)2(上海烟草(集团)公司，上海，200082)

以ORAC法为评价指标优化制备大豆抗氧化肽*

曹亚兰1，赵谋明1，郑赛晶2，任娇艳1

1(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510640)2(上海烟草(集团)公司，上海，200082)

以大豆分离蛋白为原料，用ORAC(oxyen radical absorbance capacity)法对3种商业蛋白酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)的酶解产物进行抗氧化活性评估，以制备具有抗氧化能力的大豆肽。结果表明:在其适宜酶解条件下，Alcalase酶解产物的ORAC值最高，Neutrase次之，而Pepsin酶解产物的最低。Alcalase酶解产物ORAC最高值可达Trolox当量1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide，谷胱甘肽当量1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide，说明该条件下所制备的大豆肽具有非常好的抗氧化活性。同时，研究发现，利用ORAC法测定大豆肽的抗氧化活性结果与DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)法测定的结果具有显著的相关性。

大豆肽，ORAC值，抗氧化性，DPPH自由基

大豆蛋白肽具有良好的抗氧化活性［1－4］。体外评价大豆肽抗氧化活性的方法有DPPH自由基清除率［1］、邻苯三酚自氧化法［2］、羟自由基清除率［3］、还原力［4］等。近年来，除 ORAC 方法外，FRAP、TEAC及DPPH等其他一些方法也在抗氧化研究领域中得到广泛的应用［5］。由于这些方法的自由基来源不同、反应机理不同、方法的准确度不同，因而各有优缺点。

ORAC(oxygen radical absorbance capacity)方法的研究和应用已逐渐成为抗氧化研究领域中为人们所关注的热点，该方法的灵敏度、精密度、准确度、重复性及应用范围等与其他抗氧化活性分析方法相比具有诸多显著的优点，目前已成功应用于生物样品、植物或食品提取物以及纯化合物等多种样品的体内外抗氧化能力分析。此外，研究发现，ORAC法与人类生物学相关最大，试管中得到的抗氧化能力更能反应体内的相关作用，通过改变自由基来源和溶剂可以评价亲水性和亲脂性体系的抗氧化能力［6］，应用范围广，在各种化合物和食品样品中均有应用［7－8］。2004年在第一届关于抗氧化方法的国际会议上提出了以ORAC法作为日常质量控制和抗氧化活性分析的标准方法之一［6］。但是国际上ORAC法在肽的检测上应用很少，国内对ORAC法的研究也较少。

实验中选用了3种有代表性的蛋白酶制备大豆蛋白肽，即酸性蛋白酶Pepsin、中性蛋白酶Neutrase、碱性蛋白酶Alcalase，以探讨不同特性的蛋白酶对大豆蛋白的酶解特性。同时，用ORAC法评价制备大豆抗氧化肽，由于DPPH·是所有自由基中相对比较稳定的自由基，该方法具有非常好的稳定性与重现性［9］，操作简单，因此本文同时分析ORAC法与DPPH法在评价大豆肽抗氧化活性方面的相关性，探索评价大豆肽抗氧化能力的标准方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大豆分离蛋白，蛋白质含量为90%以上;酸性蛋白酶Pepsin(测定酶活，3 800 U/g)由广州合诚实业有限公司提供;中性蛋白酶Neutrase 1.5MG，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG(测定酶活，17.6×104U/g)由诺维信(中国)生物技术有限公司提供;荧光物质Fluorescein Sodium salt(3'，6'-dihydroxyspiro［isobenzofuran2 1［3H ］，9'［9H］-xanthen］-3-one，FL)、自由基产生剂 AAPH(2，2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride)、抗氧化标准物质 Trolox(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchr oman-2-carboxylic acid)、谷胱甘肽、DPPH(1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl)均购于 Sigma公司;其他化学试剂均为国产分析纯。

GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司;THZ-82A恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司;PHS-3C精密pH计，上海雷磁精密仪器厂;KDN-2C型定氮仪，上海纤检仪器有限公司;KDN-40消化炉，上海新嘉电子有限公司;酶标仪，光谱扫描多功能读数仪，Thermo scientific(芬兰)。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解过程

按一定的底物浓度称取大豆分离蛋白和水，加酶置于一定温度下的摇床里。酶解后于沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温，离心(3000 ×g，20 min)，上清液即为酶解液。

1.2.2 蛋白质回收率的测定

采用凯氏定氮法(GB/T5009.5－2003)。

式中:N1为酶解上清液总氮量，g;N2为原料总氮量，g。

1.2.3 肽得率的测定

采用甲醛滴定法［10］。

分别用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定上清液中的总氮含量和氨态氮含量，则肽得率按式(2)计算:

式中:N1为上清液总氮量，g;N2为上清液总氨态氮量，g;N3为原料总氮量，g。

1.2.4 水解度(DH)的测定

式中:AN为酶解液中游离氨态氮的量，g;AN0为酶解前游离氨态氮量，g;N为原料总氮量，g。

1.2.5 酶解产物抗氧化活性的测定

1.2.5.1 ORAC法

对Alcalase、Neutrase、Pepsin酶解大豆分离蛋白的酶解产物进行 ORAC的测定，参照 Blanca Hernndez-Ledesma等人［11］的方法，并作适当修改。在96孔荧光板各微孔中分别加入待测样品20 μL(将各酶解产物用75 mmol/L磷酸盐缓冲液做适当稀释，每个样品待测液浓度为0.08 mg/mL)后添加75 mmol/L磷酸盐缓冲溶液20 μL及70 nmol/L FL 20 μL，在37℃下预置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入12 mmol/L AAPH 140μL启动反应，并将微孔板置于酶标仪中在37℃下以激发波长485 nm，发射波长538 nm进行连续测定，每2 min测定1次各孔荧光强度，测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止，即设为2 h。

国际上ORAC值以Trolox当量(μmol Trolox equivalent per g Peptide)来表达，本研究中的酶解产物用Trolox当量表示则可以和其他类型的抗氧化剂做比较;谷胱甘肽的ORAC值在一定的范围内线性关系也较好，本文中的r值为0.9996，本研究中的酶解产物是肽，用还原型谷胱甘肽当量(mg Glutathione equivalent per g Peptide)表达，可以很好地说明本研究中得到的大豆肽在抗氧化活性肽中的地位。

1.2.5.2 DPPH法

对Alcalase酶解大豆分离蛋白的酶解产物进行DPPH·自由基清除率的测定，参照李莹等人［12］的方法。测定5个浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50%时的蛋白浓度，即IC50值。

1.2.6 统计分析与相关性分析

除定量描述分析外，所有试验均重复3次，试验结果表述为平均值±标准偏差。方差分析采用SPSS软件(11.5版本，SPSS公司，美国)中的 One-Way ANOVA进行分析;相关性分析采用SPSS软件中的Correlate进行分析，用“*”标记有统计学意义的相关系数，如果Sig.＜0.05则用1个“*”标记，若Sig.＜0.01则用2个“*”标记。

2 结果与分析

2.1 酶解条件的选择

2.1.1 酶种类及酶解时间的确定

实验分别考察了酶解时间对Alcalase、Neutrase、Pepsin三种商业酶酶解大豆分离蛋白的酶解特性的影响，同时研究酶解时间对其酶解产物抗氧化活性的影响，分别如图1(a～f)所示。

从图1(a～c)可知，3种酶的酶解特性如下:酶解产物中蛋白质回收率与肽得率按从大到小顺序是:Alcalase＞Pepsin＞Neutrase，酶解产物中DH按从大到小顺序是:Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;3种酶酶解液中蛋白质回收率、肽得率、DH达到最大值时的时间分别为:Alcalase 12h，Pepsin 4h，Neutrase 12h，随时间延长各指标均变化不大。Alcalase酶解产物的蛋白质回收率、肽得率、DH均最高，据文献报道，Alcalase对蛋白羧端疏水性氨基酸有较强的专一性，可裂解蛋白分子中含 Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和 Gln 的羧端肽键［13］，由此可知碱性蛋白酶有着相对广泛的作用位点，故其酶解效果最佳。

从图1(d、e)可知，3种酶的抗氧化活性如下:Alcalase酶解4h时其酶解产物ORAC值可达1710.99μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox当量表示)，1535.9mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽当量表示)，均高于Pepsin、Neutrase酶解产物的最优值，原因可能是由于Alcalase有着相对广泛的作用位点，酶解效果好，酶解产物中疏水性氨基酸末端肽和小分子肽含量较高。与别的食品抗氧化活性相比，如 Carlos Aguilar-Garcia［14］研究发现，米糠的 ORAC 值在 18μg TE/mL，Alberto Dávalos［15］研究中红葡萄果汁的ORAC值高达25.0μmol TE/mL，本研究中的大豆肽的抗氧化活性可以说是摇摇领先，同时1g大豆肽的抗氧化活性相当于1.7g的谷胱甘肽，说明大豆肽是一种良好的抗氧化活性肽。

图1 酶解时间对酶解特性及产物抗氧化活性的影响

从图1(d、f)可知，2种抗氧化方法关系如下:Alcalase酶解4h时其酶解产物清除DPPH自由基的IC50值最小为7.64mg/mL，该条件下酶解产物清除DPPH·能力较强，其变化趋势与酶解产物ORAC值变化趋势一致，2种抗氧化性具有一定的相关性。

筛选出Alcalase，进一步研究其酶解条件，使其酶解产物的抗氧化活性达到最优，并进一步探讨ORAC值与清除DPPH·之间的相关性。

2.1.2 底物蛋白浓度的确定

考察了底物蛋白浓度对Alcalase酶解大豆分离蛋白的酶解特性的影响，同时研究底物蛋白浓度对酶解产物抗氧化活性的影响，如图2(a～c)所示。

从图2a可知，随着底物蛋白浓度的增加，Alcalase酶解产物中蛋白质回收率及肽得率均逐步下降，其DH却缓慢上升，这可能是因为随底物蛋白浓度的增加，蛋白质残留在渣中的含量升高，酶解液中的相对含量减少。

从图2b可知，底物蛋白浓度为6%时，Alcalase酶解产物ORAC值可达1 903.84μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox当量表示)，1 569.3mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽当量表示)。

从图2(b、c)可知，底物蛋白浓度为6%时，Alcalase酶解产物清除DPPH·的IC50值为7.98mg/mL，与最优值7.74mg/mL很接近，而且酶解产物清除DPPH·的变化趋势与ORAC值变化趋势也近乎一致，进一步证明2种抗氧化性具有一定的相关性。

图2 底物蛋白浓度对酶解特性及产物抗氧化活性的影响

图3 加酶量对酶解特性及产物抗氧化活性的影响

2.1.3 加酶量的确定

实验考察了加酶量对Alcalase酶解大豆分离蛋白的酶解特性的影响，同时研究底物蛋白浓度对其酶解产物抗氧化活性的影响，分别如图3(a～c)所示。

从图3a可知，随着加酶量的增加，Alcalase酶解产物中蛋白质回收率及肽得率均先下降后逐步上升，其DH先缓慢上升后少有下降，这是因为随加酶量的增加，酶与底物蛋白接触充分，有利于酶解，但是当加酶量达到一定程度后，几乎所有的酶分子都与底物结合，呈现“饱和”现象，加酶量的进一步增加，并不会作用于底物蛋白，不会有利于其酶解，而且还会有一定程度的抑制作用。

从图3b可知，加酶量为0.8%时，Alcalase酶解产物ORAC值可达1900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以Trolox当量表示)，1711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽当量表示)。

从图3(b、c)可知，加酶量为0.8%时，Alcalase酶解产物清除DPPH自由基的IC50值为7.08/mL，为其最优值，而且酶解产物清除DPPH自由基的变化趋势与ORAC值变化趋势也是一致，进一步验证2种抗氧化性具有一定的相关性。

2.2 相关性分析

对Alcalase酶解产物的ORAC值与其清除DPPH·的IC50值之间的相关性进行分析，其Pearson相关系数为－0.753(＊＊)，其相关系数的Sig.为0.001，小于0.01，所以 ORAC值与 IC50值在双边检测中0.01水平上负相关性是显著的，即用ORAC法与DPPH法评价大豆肽的抗氧化性大小具有一致性，这与Ichiho MikaMi等［16］的报道一致，其研究用胡萝卜素漂白法、DPPH法、ORAC法3种方法评价11种农作物的抗氧化性，发现用DPPH法与ORAC法得到的抗氧化值具有很强的相关性(0.948＜r＜0.999)。

3 结论

用3 种商业酶(Alcalase、Neutrase、Pepsin)酶解大豆分离蛋白制备抗氧化大豆肽，在各自适宜酶解条件下，酶解产物的ORAC值大小顺序为:Alcalase＞Neutrase＞Pepsin;底物蛋白浓度［S］为6%(W/W)，加酶量［E］/［S］为0.8%(W/W)，Alcalase酶解 4h时，酶解产物具有较高的抗氧化活性，其ORAC值可高达1 900.48μmol Trolox equivalent/g Peptide(以 Trolox当量表示)，1 711.91mg Glutathione equivalent/g Peptide(以谷胱甘肽当量表示)。并且验证了大豆肽的ORAC值与其清除DPPH·的能力具有显著的相关性。用ORAC值表达大豆肽的抗氧化性更具科学性，其分析方法具有很强的生物相关性，因此用ORAC法评价大豆肽的抗氧化活性是可行的，为建立标准的大豆肽抗氧化评价方法提供理论依据。

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Optimization on Preparation of Soybean Antioxidative Peptide with ORAC Assay of Evaluation

Cao Ya-lan1，Zhao Mou-ming1，Zheng Sai-jing2，Ren Jiao-yan1，
1(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)2(Shanghai Tobacco(Group)Corporation，Shanghai 200082，China)

With isolated soybean protein as raw material，three commercial proteases(Alcalase，Neutrase，Pepsin)were used to prepare soybean peptides with antioxidant ability.The antioxidant capacities(AOC)of enzymatic hydrolysates were evaluated by ORAC(oxyen radical absorbance capacity).The results showed that，in the appropriate enzymatic condition，the ORAC value of the hydrolysate zymolysised by Alcalase，which was1 900.48 μmol Trolox equivalent/g Peptide，1 711.91 mg Glutathione equivalent/g Peptide，was the highest，that by Neutrase took the second place，and that of Pepsin was the lowest.At the same time，the significant correlation between ORAC value of soybean peptide and its DPPH radical scavenging capacity was found.

soybean peptide，ORAC，antioxidant capacity，DPPH radical

硕士研究生(任娇艳为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(No.31000759)及上海烟草(集团)公司烟草行业卷烟烟气重点实验室开放基金资助项目(No.SZBCW2010－00473)

2011－06－23，改回日期:2011－08－15