Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的研究

刘 淳 张海英 韩 涛 卞 科

Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的研究

刘 淳1张海英1韩 涛1卞 科2

(北京农学院食品科学学院1，北京 102206)
(河南工业大学2，郑州 450052)

蚕豆经去皮、粉碎、除淀粉后，得到蚕豆粗蛋白。采用Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白制备蚕豆蛋白水解物。通过单因素试验，调查了pH、底物质量分数、酶用量(E∶S)和酶解温度等因素对Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白效果的影响。通过正交试验设计，确定Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白适宜的工艺参数:酶解温度60℃，底物质量分数3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，此条件下，蚕豆蛋白水解度(DH)达最大，为21．67%。该结果与Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白、绿豆蛋白和小麦蛋白等适宜条件参数接近。

蚕豆蛋白 Alcalase碱性蛋白酶 水解度

蚕豆(Vicia Faba L．)，豆科，野豌豆属，别名胡豆、南豆、罗汉豆。我国是世界上蚕豆栽培面积最大、产量最多的国家，在世界蚕豆生产中所占比重分别为48．82%和51．19%，是除大豆和花生之外种植面积和产量最多的食用豆类作物［1－2］。蚕豆含有蛋白质、纤维素、淀粉、维生素和矿物质等营养物质，其中蛋白质质量分数达25% ～35%，是蛋白含量仅次于大豆的一种重要植物蛋白资源。目前，我国食品加工业主要利用蚕豆生产粉丝、粉皮等，仅利用其中的淀粉部分，而作为重要营养成分的蛋白质未被合理利用，蚕豆多肽的研究还处于空白。

植物源多肽具有增强免疫调节力、抗衰老、抗氧化和降血压等作用。大豆蛋白酶解物和大米蛋白酶解物均具有刺激巨噬细胞吞噬的功能，可激发非特异的免疫防御系统;大豆肽对·OH自由基具有清除能力，清除率为56．5%;燕麦蛋白酶解物对血管紧张素转移酶活性(ACE)抑制率为 85．40%［3－6］。刘淳等［7］发现蚕豆蛋白酶解物具有一定的抗氧化活性。

目前，生产多肽的方法有分离提取法、化学合成法、基因重组法和酶解法等［8－13］。酶解法具有条件温和，易除杂质和水解度高等优点。Alcalase碱性蛋白酶主要成分为枯草芽孢杆菌活菌蛋白酶A，属于内切蛋白酶，应用于水解大豆蛋白、绿豆蛋白和小麦蛋白等，水解度(DH)分别为 18．79%，35．86% 和18．63%［14－16］。Alcalase 碱性蛋白酶具有高度操作安全性，符合FAO/WHO/JECFA/FCC推荐的食品级酶制剂标准［17］。目前，尚未见蚕豆蛋白应用Alcalase碱性蛋白酶进行水解的研究报道。本研究调查了Alcalase碱性蛋白酶对蚕豆蛋白酶解的影响因素，包括pH、底物质量分数、酶用量(E∶S)和酶解温度，初步确定酶解工艺参数，为工业化生产蚕豆多肽提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料及仪器

蚕豆:市售;Alcalase碱性蛋白酶(液态，活力为160 000 U/mL):Novo公司。

Anke TDL－40B型离心机:上海安亭科学仪器厂;SJ－5型pH计:上海精科有限公司;B－260型恒温水浴锅、RE52CS－1型旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;DHG－9036型电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 蚕豆蛋白的提取

取一定量干蚕豆，采用 0．50%Na2SO3，0．01%NaOH溶液浸泡6～7 h，去皮，45℃烘箱干燥备用。粉碎机粉碎，过60目筛。称取适量蚕豆粉，按固液比(g/mL)1∶15加入 Ca(OH)2并搅拌，用1 mol/L HCl调节溶液至pH 8，50℃浸提20 min。浸提液经过滤后，收集滤液。用1 mol/L HCl将滤液调至蚕豆蛋白等电点pH 4．2，边加酸边搅拌，3 000 r/min离心15 min，收集沉淀物，低温烘干，沉淀物即蚕豆蛋白［18－21］。

1．2．2 蚕豆蛋白酶解工艺

蚕豆蛋白分别溶于磷酸缓冲液(pH:7．0、8．0、8．5、9．0、10．0)制备(底物质量分数 2%、3%、5%、7%、9%)溶液，90℃水浴10 min，冷却至酶解温度。准确加入Alcalase碱性蛋白酶(2%、4%、5%、6%、8%)，在低温水浴振荡器中进行恒温酶解(温度50、55、60、65、70℃)，同时用pH计测定反应体系中pH，开始计时。反应过程中用1 mol/L NaOH溶液滴定，使系统pH维持恒定(±0．10)，每隔一定时间记录一次NaOH体积读数，时间300 min。用6 mol/L HCl将水解液调至蚕豆蛋白等电点pH 4．2。90℃水浴15 min灭酶。10℃，12 000 r/min离心10 min，去除未水解蚕豆蛋白和其他非溶性物质。上清液置于4℃ 冷藏保存。计算水解度。

1．2．3 蚕豆蛋白水解单因素试验

本试验以pH、底物质量分数、酶用量(E∶S)和酶解温度为影响因素，首先进行单因素试验，各因素的试验范围为 pH:7．0、8．0、8．5、9．0、10．0;底物质量分数:2%、3%、5%、7%、9%;酶用量(E∶S):2% 、4% 、5% 、6% 、8%;酶解温度:50、55、60、65、70℃;时间300 min。试验以水解度(DH)为指标，研究Alcalase碱性蛋白酶水解蚕豆蛋白的工艺参数。试验按照单元操作进行，除所研究因素，其他各因素参考文献［14－16，22－24］:pH 9．0，底物质量分数 5% ，酶用量(E∶S)10%，酶解温度60℃，反应时间300 min。

1．2．4 蚕豆蛋白水解工艺正交试验

根据单因素试验，采用L9(34)正交表(表1)，考察4个因素，即温度，底物质量分数，酶用量(E∶S)，pH对水解度(DH)的影响。

表1 蚕豆蛋白水解工艺正交试验因素水平设计L9(34)

1．2．5 蚕豆蛋白水解度测定

蚕豆蛋白水解度(DH)测定与控制采用pH－stat法［25－28］。蛋白质的水解程度常以蛋白中的肽键被断裂的百分率表示。pH－stat法具有操作简单，可连续测定等优点。其原理是在一定条件下，酶解过程中1 mol肽键的断裂会导致α摩尔(解离常数)H+的净释放，导致体系pH降低，而维持恒定pH需消耗相同量的OH－，所以可通过测定OH－消耗量计算水解度。

式中:V为消耗碱量/mL;c为氢氧化钠物质的量浓度/mol/L;α为蚕豆蛋白氨基的平均解离度，试验条件下为0．89;m为底物蛋白的总质量/g;h为每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，h=7．92(取h大豆=8．38，h燕麦=7．31，h杏仁=7．58，h大米=8．40 的平均值)。

试验数据均为平行3次结果的平均值，并计算标准偏差(±SE);正交试验结果采用SAS统计软件分析。

2 结果与分析

2．1 pH对蚕豆蛋白水解效果的影响

pH对酶解反应影响的原因是多方面的。根据过酸或过碱的程度不同，酶会发生可逆或不可逆失活，并且pH可改变底物分子及酶的解离状态，影响它们的结合，从而降低酶的活性。

图1 不同pH下蚕豆蛋白不同时间的水解度

蚕豆蛋白水解度在不同pH下有明显差异(图1)。pH 为 7．0、10．0的水解度在 0～10 min有一定增加，10 min后，水解度几乎不再明显变化;pH为9．0的水解度在0～30 min迅速增加，30 min后，水解度不再明显变化;pH为8．0、8．5的水解度在0～120 min迅速增加，120 min后，水解度不再明显变化。pH为9．0，蚕豆蛋白水解度最高，其次是pH 8．5、8．0、7．0、10．0，且各 pH 下水解度差异显著。表明蚕豆蛋白的水解宜在弱碱性条件下进行。

2．2 底物质量分数对蚕豆蛋白水解效果的影响

选取2．1中水解度最大值对应的pH 9．0，考察底物质量分数分别为2%、3%、5%、7%、9%对蚕豆蛋白水解效果的影响，结果见图2。

图2 不同底物质量分数下蚕豆蛋白不同时间的水解度

蚕豆蛋白水解度在不同底物质量分数下有一定差异。底物质量分数为2%、7%的水解度在0～30 min迅速增加，30 min后，水解度几乎不再明显变化;底物质量分数为3%、9%的水解度在0～70 min迅速增加，70 min后，水解度不再明显变化;底物质量分数为5%的水解度在0～120 min迅速变化，120 min后，水解度基本不再变化。底物质量分数5%的蚕豆蛋白水解度为最高，其次是底物质量分数为3%、9%、7%、2%。达稳定水解度后，3%和5%之间、7%和9%之间均差异不显著，但3%和5%的水解度明显高于7%和9%，后者又明显高于2%。

2．3 酶用量(E∶S)对蚕豆蛋白水解效果的影响

选取2．2中水解度最大值对应的底物质量分数5%，考察酶用量(E∶S)分别为2%、4%、5%、6%、8%对蚕豆蛋白水解效果的影响，结果见图3。

图3 不同酶用量(E∶S)下蚕豆蛋白不同时间的水解度

蚕豆蛋白水解度在不同酶用量(E∶S)下有明显差异。酶用量(E∶S)为2%的水解度在0～10 min迅速增加，10 min后，水解度几乎不再明显变化;酶用量(E∶S)为4%、8%的水解度在0～70 min迅速增加，70 min后，水解度基本没有变化;酶用量(E∶S)为5%、6%的水解度在0～120 min迅速变化，120 min后，水解度没有明显变化。酶用量(E∶S)以6%的蚕豆蛋白水解度最高，其次是酶用量(E∶S)为8%、4%、2%、5%;除2%外，水解30 min后，各酶用量(E∶S)之间差异明显。

2．4 温度对蚕豆蛋白水解效果的影响

选取2．3中水解度最大值对应的酶用量(E∶S)6%，考察酶解温度分别为50、55、60、65、70 ℃对蚕豆蛋白水解效果的影响，结果见图4。

图4 不同温度下蚕豆蛋白不同时间水解度

蚕豆蛋白水解度在不同温度下有明显差异。温度为60、65、70℃的水解度在0～10 min迅速增加，10 min后，水解度略有上升;温度为50、55℃的水解度在0～120 min迅速增加，120 min后，水解度也略有上升。55℃下蚕豆蛋白水解度最高，其次是60、50、65、70 ℃，各温度下水解度差异基本明显，50、55、60℃的水解度几乎是65、70℃的2倍。表明蚕豆蛋白的水解不宜高于60℃。

2．5 蚕豆蛋白水解工艺正交试验结果分析

采用正交试验设计对酶解工艺参数进行优化试验。在单因素试验的基础上，选取温度、底物质量分数、酶用量(E∶S)、pH为主要因素，以水解度作为指标，通过L9(34)正交试验，确定Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的适宜工艺参数。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

由极差分析(表2)可知，各试验因素对蚕豆蛋白水解度的影响主次顺序为B＞D＞C＞A，即底物质量分数对蚕豆蛋白水解度影响最大，其次为pH，酶用量(E∶S)，温度对蚕豆蛋白水解度影响较小。Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白适宜工艺参数为B1D3C3A2，即底物质量分数 3%，pH 9．0，酶用量(E∶S)8%，温度60 ℃。

表2 Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白正交试验结果

表3 Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白正交试验结果的方差分析表

由方差分析(表3)可知，显著水平α=0．05，总变异系数的 P 值 =0．011 7 ＜0．05，说明A、B、C、D 因素，即温度、底物质量分数、酶用量(E∶S)、pH对水解度产生显著影响;B因素的P值=0．011 2＜0．05，说明B因素对水解度影响显著，即底物质量分数是影响水解度主要因素，与表2极差分析结果一致。

为验证正交试验的结果，进行验证试验:温度60℃，底物质量分数1%、3%、5%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0。从表4中可知，通过验证试验确定Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的适宜工艺参数是正确的。

表4 Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白验证试验结果

综合以上分析，Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白适宜工艺条参数为:酶解温度60℃，底物质量分数3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，水解度为21．67%。

3 讨论与结论

本研究调查了酶解温度、底物质量分数、酶用量(E∶S)、pH对Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白效果的影响，通过单因素试验和正交试验设计得到Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白适宜的工艺参数及影响蚕豆蛋白水解度主要因素:酶解温度60℃，底物质量分数3%，酶用量(E∶S)8%，pH 9．0，水解度为21．67%，底物质量分数是影响蚕豆蛋白水解度主要因素。

Alcalase碱性蛋白酶水解大豆蛋白、绿豆蛋白和小麦蛋白的水解度为18．63% ～35．85%，酶解温度为58～65℃，底物质量分数为4% ～9%，pH为8．0～9．6。本试验结果的水解度、温度、pH 均在上述范围内，底物质量分数稍有差异。

Alcalase碱性蛋白酶能较有效水解蚕豆蛋白。Alcalase碱性蛋白酶来源广泛，国内可工业化生产，其产品安全可靠，价格低廉，因此采用Alcalase碱性蛋白酶作为蚕豆蛋白水解酶是可行的。

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Study on Hydrolyzing of Protein from Broad Bean by Alcalase Protease

Liu Chun1Zhang Haiying1Han Tao1Bian Ke2
(Institute of Food Science，Beijing University of Angriculture1，Beijing 102206)
(Henan University of Tech－nology2，Zhengzhou 450052)

Broad bean was peeled and smashed to separate starch and then to obtain crude proteins．Alcalase protease was used to hydrolyze isolated broad bean protein for investigating the degree of hydrolysis of the protein．The effects of main parameters，including pH value，substrate mass fraction，enzyme dosage(E∶S)and hydrolysis temperature，were observed．The suitable conditions obtained by single － factor and orthogonal tests，i．e．hydrolysis temperature 60℃，substrate mass fraction 3%，enzyme dosage(E∶S)8%，pH 9．0，and the degree of hydrolysis was21．67%under the condition．The result was close to those from the hydrolyzations in soybean protein，green bean protein and wheat protein by Alcalase protease．

broad bean protein，alcalase protease，degree of hydrolysis

A

1003－0174(2011)12－0029－05

北京市重点建设学科资助(PXM2009－014207－078 172)

2010－01－13

刘淳，女，1986年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

韩涛，男，1963年出生，教授，硕士生导师，农产品加工及贮藏工程