一锅法制备聚邻氨基酚-纳米金-酶膜用于葡萄糖安培传感

李鹏昊,傅迎春,王 婷,部丽娟,谢青季,姚守拙

(湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室，化学化工学院，中国 长沙 410081)

高效固定酶分子是研制安培型酶电极的关键步骤，而采用导电或绝缘聚合膜基质是有效固定酶分子的常用方法[1-6]，其中绝缘聚合膜常能更好地抑制抗坏血酸、尿酸等共存电活性物质的干扰[2, 5, 6]．化学聚合和电化学聚合法是两种常用的原位固定酶的方法，前者更易实现更高的酶负载量和固定酶活性[5, 6]，而后者更易于精确控制膜厚．我们将化学聚合和电化学聚合法相结合，提出了一种原位化学预氧化并电聚合单体的方法，所制酶电极性能优异[7]．纳米材料及其在分析化学中的应用近年来备受重视，包括纳米复合材料在研制生物传感器的应用[8, 9]．然而，采用简便的一锅法制备生物纳米复合物的工作目前并不多见．

本文中，我们基于HAuCl4和邻氨基酚(oAP)的化学反应及oAP的电聚合反应，在葡萄糖氧化酶(GOx)共存条件下，研制了电合成的聚邻氨基酚(PoAP)-邻氨基酚寡聚物(oAPO)-金纳米颗粒(AuNPs)-GOx复合物酶膜，用于安培传感分析葡萄糖，性能优异．采用电化学石英晶体微天平(EQCM)实时监测了酶电极制备过程．

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

所有电化学实验均在CHI660电化学工作站(CH Instrument Co., USA)上进行．EQCM实验采用HP4395A网络/频谱/阻抗分析仪(Agilent, USA)．采用直径12.5 mm的AT切9 MHz压电石英晶体(北京晨晶电子有限公司)，双面镀金，实验中单面触液．直径6 mm的金电极为工作电极，参比电极为饱和KCl甘汞电极(SCE)，对电极为碳棒．采用Pico Scan 5型(Agilent，USA)原子力显微镜．

GOx(EC 1.1.3.4; Ⅱ型，源自黑曲霉菌，活性均为150 kU·g-1)购自Roche公司 (Japan)，葡萄糖购自上海化学试剂公司．oAP购自广东台山化工厂．磷酸缓冲溶液 (PBS，pH 7.0) 配比为0.1 mol·L-1K2HPO4/KH2PO4+ 0.1 mol·L-1K2SO4．实验中使用的所有化学试剂均为分析纯或更高纯度．使用的水为Milli-Q超纯水(电阻率≥18 MΩ·cm)．

1.2 实验步骤

金工作电极经化学和电化学处理．电极表面先滴加浓硫酸和双氧水的混合液(vH2SO4∶vH2O2=3∶1)清洗，再在0.2 mol·L-1HC1O4水溶液中进行电位环扫(电位区间0 ～ 1.5 V vs.SCE，扫速30 mV·s-1)，直至循环伏安曲线重现．

在1 mL含15 mmol·L-1oAP的除氧PBS溶液中，加入1 mg GOx，搅拌溶液，缓慢加入40 μL 10 mmol·L-1HAuCl4(或12 μL 0.1 mmol·L-1K3Fe(CN)6)化学氧化剂，单体氧化后可得到短链寡聚物和少量长链聚合物(以下统称为寡聚物)[7, 10]并包埋AuNPs和GOx，得到oAPO-AuNPs-GOx纳米复合物悬浊液．将处理后的金电极浸入上述悬浊液中，电位环扫(0 ～ 1.2 V，扫速30 mV·s-1)，得PoAP-oAPO-AuNPs-GOx(或PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6)酶膜．采用EQCM监测过程．电极水洗后，存于PBS缓冲液中备用．基于常规电聚合方法的酶膜(PoAP-GOx)制备类似，但无HAuCl4或K3Fe(CN)6．所制酶电极储存于PBS中备用(4 ℃冰箱)．

酶电极检测采用三电极系统，将酶电极置于10 mL pH 7.0的PBS缓冲液中，在0.7 VvsSCE恒电位下，检测葡萄糖溶液加入前后的稳态阳极电流变化(对应于酶生H2O2的电氧化)．所有实验均在室温下进行．

2 结果与讨论

2.1 酶电极的制备及表征

图1为oAPO-AuNPs-GOx悬浊液的电聚合响应图．可见，过量的oAP单体在0.04 V开始氧化，而在0.2 V出现了频率的下降，表明oAPO-AuNPs-GOx和PoAP在电极表面开始共沉积．因为PoAP膜的绝缘性，电流和频率响应逐圈显著下降．三圈后，总频率下降约3800 Hz，而动态电阻上升了约25 Ω，-Δf0/ΔR1=152 Hz·Ω-1，明显大于粘密度效应特征值10 Hz·Ω-1[2, 11-13]，表明该聚合膜高度刚性．图2为酶膜的原子力显微镜(AFM)图，可见膜粗糙多孔，颗粒直径约90 nm．

我们对酶电极制备及检测条件进行了优化(图略)．当膜厚为3 800 Hz时，酶电极的电流响应最大．因实验条件下oAP的最大可溶解浓度约15 mmol·L-1，故采用此浓度实验．实验中采用0.4 mmol·L-1的HAuCl4浓度，因为HAuCl4浓度过低，不利于化学聚合反应的发生和酶的包埋，过高则易产生纳米金和聚合物沉淀．此时HAuCl4的质量分数为0.016%，而Frens法所用HAuCl4质量分数0.01%基本一致[14]．实验中选择GOx浓度为1 g·L-1，过低会影响酶的固定效率，过高则抑制聚合反应．选择酶电极的工作电位为0.7 V和检测溶液pH值为7.0，与文献报道结果[2, 3, 7]一致．

图1 在含15 mmol·L-1 oAP, 1 g·L-1 GOx和0.4 mmol·L-1 HAuCl4的PBS溶液中电流、频率和阻抗随电位环扫的响应曲线，扫速：10 mV·s-1

图2 PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修饰电极的AFM图

2.2 酶电极性能

在最优条件下，分别制备了PoAP-GOx、PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6以及PoAP-oAPO-AuNPs-GOx修饰电极并考察了酶电极对葡萄糖的响应性能(图3及表1)．可见，PoAP-oAPO-AuNPs-GOx电极的灵敏度最高，分别是PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6和PoAP-GOx电极的1.7倍和4.5倍，优于很多文献报道的第一代GOx生物传感器[1-3, 11, 13]．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶电极的检测下限比其余两酶电极降低了一个数量级．PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶电极的优异性能可归因于：(1)固定酶的高负载量和高活性；(2)纳米金的导电能力和催化特性．

图3 PoAP-GOx (1), PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)6 (2)和PoAP-oAPO-AuNPs-GOx (3)修饰电极对浓度递增葡萄糖的电流响应(A)及工作曲线(B)．插图为线性响应区间的工作曲线

电 极灵敏度/(μA mmol·L-1·cm-2)线性范围/(mmol·L-1)检测限/(μmol·L-1)PoAP-GOx9.80.002～1.609.4PoAP-oAPO-GOx-K3Fe(CN)626.40.005～1.531.5PoAP-oAPO-AuNPs-GOx44.00.005～1.530.3

考察了上述三种酶电极的抗干扰性能．0.1 mmol·L-1抗坏血酸和尿酸的加入对2 mmol·L-1葡萄糖的电流响应基本上无干扰(低于5%)．也考察了所制PoAP-oAPO-AuNPs-GOx酶电极的操作稳定性及储存稳定性．连续10次测试2 mmol·L-1葡萄糖，电流响应的相对标准偏差在5%以内；连续50 d对酶电极进行了检测，2 mmol·L-1葡萄糖的电流响应值保持在其最初响应的80%以上，表明该电极操作和储存稳定性俱佳．

3 结论

本文所提出的纳米复合物制备方法可高负载量和高活性地包埋酶，酶电极制备方法简便、高效，酶电极性能优异，可望在生物传感、生物材料和生物催化等领域进一步应用．

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