响应面法优化混合酶-超声波联合提取栀子黄色素工艺研究

胡居吾，李雄辉*，熊 伟，季清荣，涂招秀，李向阳

1江西省科学院应用化学研究所;2江西省科院天工科技有限责任公司，南昌330029

响应面法优化混合酶-超声波联合提取栀子黄色素工艺研究

胡居吾1，李雄辉1*，熊 伟1，季清荣2，涂招秀1，李向阳1

1江西省科学院应用化学研究所;2江西省科院天工科技有限责任公司，南昌330029

以栀子为原料提取栀子黄色素，将混合酶-超声波技术相结合，对栀子黄色素进行了提取的研究。为了获得提取栀子黄色素最佳工艺条件，采用响应面法组合设计试验方法，建立了酶的用量、提取温度、提取时间之间关系。结果表明，最佳工艺条件为酶的用量4.33%，提取温度61.84℃，提取时间65.06 min，在此最佳提取条件下，栀子黄色素的吸光度为0.914。

栀子黄色素;响应面分析;超声提取

栀子(Gardenia jasminoides Ellis)为茜草科植物，又名黄栀子、山枝子、大红栀子(江苏)、白蝉(广东)。栀子主治感冒、发热、烦躁、失眠等［1］。栀子果中黄色素约占果实重量的10%［2］，栀子黄色素为橙色粉末，易溶于水，溶液透明，无异味;难溶于无水乙醇、乙醚等有机溶剂。由于栀子果中含有大量的果胶和纤维素等物质，使得栀子黄色素在提取过程中不容易溶解出来，故本研究在栀子黄色素的提取过程中，加入果胶酶和纤维素酶组成的混合酶(果胶酶∶纤维素酶=1.5∶1)，可以大大提高栀子黄色素的提取率，同时又能使栀子黄色素后续的纯化过程降低难度。同时在提取过程中采用超声波的辅助作用将细胞破碎，使被提取物能够快速、高效地进入提取介质，缩短提取时间，增加提取效率。在实验设计中采用了响应面试验设计方法，有助于快速建模、缩短优化时间和提高工程应用可信度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

栀子购于江西省抚州市江西天顺生态农业有限公司，在50～75℃之间程序升温干燥，时间为2～3 h，后粉碎过40目筛;栀子黄色素标准品:北京生物制品检验中心;果胶酶(固体型:5万U/g)、纤维素酶(固体型:3万U/g)张家港市金源生物化工有限公司;超声波循环发生器(HF-5B)北京弘祥科技公司;紫外分光光度计(751型)上海第二分析仪器厂;旋转蒸发器(RE-52AA)北京医用离心机厂;YC-015实验室微型喷雾干燥机上海雅程仪器设备有限公司;电子天平(AE163)余姚纪铭设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

栀子果→干燥→脱壳→粉碎→过筛(40目)→水提(料液比1∶9)→第一次加入一定量的混合酶→在一定的温度下超声(250 W)提取一定的时间→纱布过滤→第二次(料液比1∶7)不再加入混合酶，在上述温度下超声(250 W)提取相同的时间→纱布过滤→合并滤液→离心(4500 r/min，10 min)→上清液→检测其吸光度(波长440 nm)→喷雾干燥→产品。

1.2.2 单因素试验

1.2.2.1 混和酶用量的确定

分别称取10 g原料放入锥形瓶中，加入相同体积的水，然后分别加入3.0%、4.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%(与原料重量比)的混和酶，在额定功率、相同的时间和温度下进行超声提取，分别测定溶液的吸光度。

1.2.2.2 提取温度的确定

分别称取10 g原料放入锥形瓶中，加入相同体积的水，然后在50、55、60、65、70、75℃的恒温水浴中，在额定功率、相同的时间和一定酶用量下进行超声提取，分别测定溶液的吸光度。

1.2.2.3 提取时间的确定

分别称取10 g原料放入锥形瓶中，加入相同体积的水，然后在60、65、70、75、80 min下，并在额定功率、相同的温度和一定酶用量下进行超声提取，分别测定溶液的吸光度。

1.2.3 测定方法

取离心后的上清液1 mL定容于250 mL容量瓶，再稀释30倍，在波长440 nm处测定其吸光度。

1.2.4 响应面试验优化栀子黄色素的提取工艺

在正交试验基础上选取混合酶的用量、提取温度及提取时间对本试验主要影响的三个因素，设试验因素与水平，根据试验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，每一个自变量设计低中高三个水平。见表1。

表1 响应面试验因素水平及编码Table 1 Levers and code of response surface experiments

设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为:

Y=X0+X1A+X2B+X3C+X12AB+X13AC+ X23BC+X11A2+X22B2+X33C2式中:Y—预测响应值;X0—常数项;X1、X2、X3—线性系数;X12、X13、X23—交互项系数;X11、X22、X33—二次项系数;

2 结果和分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 混和酶的用量对栀子黄色素吸光值的影响

图1 混和酶的用量对栀子黄色素吸光值的影响Fig.1 Effects of mixed-enzyme dosage on absorbance of gardenia yellow

由图1可知，随着混和酶的用量的增加，栀子黄色素吸光值增大，但用量达到6.0%以后，吸光值不再增大，这时与酶作用的底物已反应完全，故混和酶的用量在5.5～6.0之间。

2.1.2 反应温度对栀子黄色素吸光值的影响

图2 温度对栀子黄色素吸光值的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on absorbance of gardenia yellow

由图2可知，随着提取温度的上升，栀子黄色素吸光值增大，本实验最终选在60～70℃之间，原因是随着温度的增加(大于70℃)，可能会破坏栀子黄色素的结构，同时在大于70℃时，混和酶在高温下其活性会降低，甚至会失活。

2.1.3 反应时间对栀子黄色素吸光值的影响

图3 提取时间对栀子黄色素吸光值的影响Fig.3 Effects of extraction time on absorbance of gardenia yellow

由图3可知，超声时间在50～60 min时，栀子黄色素吸光值最大，也就是栀子黄色素的得率最高。随着的再延长，其得率降低，其原因可能是由于超声时间太长，会破坏栀子黄色素的结构，导致其吸光值下降。故超声取提取时间在60 min左右为宜。

2.2 响应值结果及其拟合模型

根据响应面试验设计原理，综合正交试验所得结果，选取混合酶的用量、提取温度及提取时间对本试验主要影响的三个因素，对提取工艺进行响应面分析，其具体试验方案及结果见表2。

2.3 模型方程的建立及显著性分析

表2为不同试验条件下所测定的吸光度值，利用Design-expert 6.0.5软件和SAS 8.2软件对表2中吸光度值进行多元回归拟合，表3为回归分析结果，当“Prob＞F”值小于0.05即表示该项指标显著，说明该模型与实际试验拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于栀子黄色素吸光度值试验的理论预测。回归方程各项的方差分析结果还表明方程的一次项、二次项的影响都是高度显著的。各因素经回归拟合后，选择对响应值显著的各项，得到吸光度值对编码自变量混合酶的用量、提取温度和提取时间的二次多项回归方程为:

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Analysis and result of response surface experiments

表3 回归方程系数及其显著性检验Table 3 Regression coefficients and their significance

注:“P＜0.05”表示差异显著;Note:“P＜0.05”means difference significant

2.4 主因子效应分析

从表3可以得出:MSx1=0.000561;MSx2= 0.004513;MSx3=0.0004095;所以，影响栀子黄色素提取的三因素主次顺序是:提取温度＞提取时间＞酶的用量。

2.5 栀子黄色素的响应曲面分析

RSM法的图形是特定的响应面y对应的因素x1、x2、x3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以找到它们在反应过程中的相互作用。相应曲面图和等高线图4所示。

图4 y=f(x1、x2、x3)的响应面与等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot

由图4可知，在一定的时间(X3)下，升高提取温度(X2)可以先增大栀子黄色素的吸光度，后又呈现下降的趋势，可能由于随着温度的升高，一是造成溶液中的色素不稳定分解;二是使混合酶部分失活，因为这两种酶的最适温度都在55～65℃左右，所以当温度在55～65℃之间，吸光度较高。

2.6 最佳工艺条件的选择

通过软件Design-Expert 6.0.5和SAS 8.2求解方程，给出了最佳萃取工艺条件为:酶的用量4.33%，提取温度61.84℃，提取时间65.06 min，在此最佳提取条件下，栀子黄色素的吸光度为0.914。证实验中的工艺条件为:酶的用量4.33%，提取温度62.00℃，提取时间65.00 min，验证结果较好。

2.7 喷雾干燥

最后在上述的最佳萃取条件下，将上清液进行喷雾干燥，进风温度为180℃，出口温度为90℃，得达栀子黄色素粉末。与不加上述混合酶相比，提取率增加了12.4%。

3 结论

3.1 从栀子中提取黄色素属于传质过程，本实验借助超声波产生的脉动、机械振动、扩散、乳化、击碎等作用，可以大大地增加流体湍流程度及相接触面，从而强化了传质;另外，介质吸收超声波后，能将其转化成热能，从而导致物料内部温度升高，加速了有效成分的溶解，有效地提高了色素的提取速率。超声波提取法与常规法相比较，具有提取时间短、色素提取率高等优点，可以大大地提高生产效率。

3.2 在超声波提取过程中，加入纤维素酶时，破坏植物细胞壁，使栀子黄色素快速从栀子果实中全部溶出来，并可以降低提取温度，从而可以节省能源和防止黄色素在温度下分解;栀子中含有大量的果胶，果胶会随着提取栀子黄色素时也会大量溶于水中，果胶会很容易凝固，使提取液很难过滤，并且会使栀子黄色素得率降低，当加入果胶酶后，可有效的防止上述情况的发生。

3.3 有关研究表明［3］，栀子黄色素在pH 3.5～11.0之间比较稳定，但在强酸、强碱中，观察到溶液颜色变淡，吸光度明显变小，这主要是因为强酸、强碱破坏藏花、藏花酸的结构;同时纤维素酶和果胶酶的最适pH范围在3.5～5.0之间，故整个提取体系中用调酸调至3.5～5.0之间。

3.4 在本实验中没有对物料与提取溶剂之间的关系作研究，第一次提取时的料液比为1∶9，第二次的料液比为1∶7。

3.5 结果表明，在提取工艺条件中，当酶的用量4.33%，提取温度61.84℃，提取时间65.06 min。证实验中的工艺条件为:酶的用量4.33%，提取温度62.00℃，提取时间65.00 min，验证结果较好。在此最佳提取条件下，栀子黄色素的吸光度为0.914，处于较高水平，这为栀子黄色素的工业生产及后续精制纯化工艺提供了可借鉴的理论依据。通过实验表明，加入酶能提高提取率，并缩短提取时间，而且在最终得到较纯品时，送到检测机构进行检测，表明加入的这两种酶不会破坏栀子黄色素的结构。3.6 用吸光度的方法测其吸光度时，在波长440 nm处，酶解产物及其它物质对吸光度的影响不大，我们用HPLC法作了对比，相差不到2%，而且在实验过程中，用吸光度法测量更方便。

1 Liu CL(刘成伦)，Xu LJ(徐龙君).Study advance on the Gardenia pigments.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，1996，(6):69-73.

2 Ma ZC(马自超)，Peng YZ(庞业珍).Chemistry of Edible Pigment and Produce Technology.Beijing:China Forestry Publishing House，994.25-36.

3Yao LX(姚立霞)，Wang XL(汪雪丽)，Du XF(杜先锋).Optimization of ultrasonic extraction technology of gardenia yellow.Food Sci(食品科学)，2008，29:197-199.

Optimization of Mixed-Enzymes and Ultrasonic Extraction Technology of Gardenia Yellow by Response Surface Method

HU Ju-wu1，LI Xiong-hui1*，XIONG Wei1，JI Qing-rong2，TU Zhao-xiu1，LI Xiang-yang11Institute of Applied Chemistry，Jiangxi Academy of Sciences;2Tian-Gong Technology Co.，Ltd.of Academy of Sciences，Nanchang 330029，China

The extraction of gardenia yellow from Gardenia jasminoides Ellis was studied in this paper and gardenia yellow was extracted by mixed-enzymes and ultrasonic extraction technology，and the mathematical model of correlation among enzyme dosage，extraction temperature，extraction time were established by means of response surface method.The results indicated that the optimum extraction conditions are as follows:enzyme dosage 4.33%，extraction temperature 61.84℃，and extraction time 65.06 min.Under these conditions，the absorbance of gardenia yellow is 0.914.

gardenia yellow;response surface method;ultrasonic extraction

1001-6880(2011)03-0551-05

2009-11-09 接受日期:2010-04-08

农业科技成果转化资金项目(2008GB2C500163)

*通讯作者 E-mail:kxylxh0215@126.com

R284.2;Q946.91

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