糖蜜草挥发性成分HS-SPME-GC-MS分析

高广春，郑许松，徐红星，吕仲贤

浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，杭州310021

糖蜜草挥发性成分HS-SPME-GC-MS分析

高广春，郑许松，徐红星，吕仲贤*

浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，杭州310021

本文首次采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)提取该植物挥发性成分，然后通过气质联用技术(GCMS)结合保留指数以及标样对照对化学成分进行了定性，并通过峰面积归一化法计算出各组分的相对百分含量。试验确定了PDMS/DVB固相微萃取对糖蜜草挥发物的萃取效果最好，并从中鉴定出33种化合物占总挥发性成分的90.94%，主要为烷烃和萜烯类化合物。该研究为开发糖蜜草作为水稻螟虫的驱避植物进行害虫安全有效防治提供理论依据，并为驱避性挥发物的田间应用奠定基础。

糖蜜草;固相微萃取;气质联用;挥发性成分;

植物与植食性昆虫之间存在着复杂的联系，它们共同进化、共同发展［1］。植物为了抵御害虫的侵害在进化过程中成功的“制造”出一系列天然的次生代谢物，其中包括具有直接毒性或是驱避性化合物和对天敌具有引诱作用的化合物等［2］。植物释放的易挥发性化合物是植食性昆虫寻找寄主植物的重要线索，它调控着昆虫的定向、识别、取食等行为［3］。农业上可以利用目标作物与害虫的这一化学信息联系对害虫进行引诱、驱避、迷向等外界干扰达到害虫的安全防治。在我国鳞翅目害虫大螟(Sesamia inferens，夜蛾科)和二化螟(Chilo suppressalis，螟蛾科)是危害水稻最重要的常发性害虫，也是茭白、甘蔗、玉米等作物上的重要害虫。近年来，由于优质高产水稻品种和免耕栽培等新技术的推广、全球变暖、大量使用农药导致抗药性产生等原因使水稻螟虫的种群数量和成灾面积大幅度上升，给我国的农业生产造成了重大损失。目前螟虫防治主要通过施用化学农药，但随着害虫抗药性的增加以及用药对环境安全和人类健康的危害等问题的出现化学农药的安全性面临着挑战，其有效性也由于大螟和二化螟幼虫具有很好的隐蔽性成虫是夜间活动的特点大大折扣，通过寄主植物挥发物调控螟虫行为进行害虫防治［4］应运而生，成为一项新的研究领域。

糖蜜草(Melinis minutiflora P.Beauv)属于禾本科(Poaceae)糖蜜草属，它的茎和叶片上密生腺毛能分泌甜味粘液，具有香味。在非洲的肯尼亚地区糖蜜草被用作驱避植物间作于玉米田中防治班禾草螟(Chilo partellus)和玉米楷夜蛾(Busseola fusca)［5］取得了很大的经济效益。螟虫行为驱性试验证明间作于玉米田中糖蜜草的挥发物不仅能够驱避雌蛾而且能够增加寄生性天敌大螟盘绒茧蜂的寄生率［6，7］，有效的减小了害虫的危害并增加了作物的产量。室内试验发现该植物水蒸气提取物对班禾草螟怀卵雌成虫的产卵量为2.2(对照产卵量为40.9)，田间试验发现玉米单一种植虫害率为39.2%，而间作糖蜜草后虫害率降低到4.6%［6］。大螟和二化螟同玉米螟一样都是钻蛀性害虫，对于该植物对以上两种螟虫是否具有驱避作用以及驱避作用成分的研究还未见报道。本研究通过固相微萃取技术采集糖蜜草的挥发物，然后利用GC-MS结合保留指数以及标样对照对挥发性成分进行分离鉴定，为下一步更好地利用糖蜜草挥发性成分驱避水稻螟虫奠定基础，也为合理进行水稻种植提供理论依据。

1 仪器与材料

GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司);手动固相微萃取(SPME)装置(美国Supelco公司)，萃取头(Polyacrylate(PA)85 μm; polydimethylsiloxane(PDMS)100 μm;polydimethylsiloxane/divinybenzene(PDMS/DVB)65 μm);毛细管色谱柱Rtx-5MS(0.25 μm×30.0 m×0.25 mm)。

标准样品芳樟醇(美国Alfa，97%)、壬醛(美国Alfa，98%)、别罗勒烯(日本TCI，＞90%)、萘(上海)、水杨酸甲酯(上海，98%)、癸醛(美国Alfa，96%)、吲哚(上海)、α-雪松烯(Sigma，99%)、石竹烯(日本 TCI，＞90%)、α-葎草烯(日本TCI，＞93%)，柏木脑(98%)，正十四烷(Sigma-Aldrich，≥99%)和正十六烷(Sigma-Aldrich，≥98%)。C8～C40混标(含植烷和姥鲛烷)购于上海西域公司(美国Accustandard)。

糖蜜草于2009年8月采自浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所试验田。

2 实验方法

2.1 样品制备

取样前先将试验用三种萃取头在气相色谱进样口老化0.5 h，老化温度250℃。选取新鲜干净的糖蜜草放入2 L的广口瓶内，用封口膜封口后，置于45℃的水浴锅内，将固相微萃取装置的针头穿透封口膜，插入瓶内植物体上方，然后小心的推出纤维头，同时用铁架台固定固相微萃取装置的手柄，自萃取纤维头推出后开始计时，待吸附完毕后(60 min)立即在GC-MS进样口(250℃)解吸附(1 min)进行化学成分分析。各标准样品气质分析采用气相微量注射器(5 μL)顶空吸取样品直接进样(1 μL)。

2.2 GC-MS分析

色谱条件:色谱柱为Rtx-5MS(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)石英毛细管柱;载气氦气(99.999%);色谱柱起始温度为40℃，保持2 min，然后以8℃/ min升温至150℃，然后再以3℃/min升至250℃，恒温5 min。不分流进样。

质谱条件:电离方式为EI源，电离能量70 eV;离子源温度200℃;接口温度250℃;质量扫描范围为m/z 45～500;谱图检索:采用 NIST08.L和NIST08s.L进行检索。

2.3 KI测定

取正构烷烃烷烃混标(C8-C40)按照上述气相色谱和质谱条件进样分析，测定各正构烷烃的保留时间，再在完全相同的气相色谱和质谱条件下对采集的样品进行分析，测定各组分的保留时间，根据下面公式计算出各组分的Kovats保留指数［8］。

式中KI样品—样品色谱峰的KI;KI前—样品色谱峰前面烷烃标样的KI;Rt样品—样品色谱峰的Rt;Rt前—前面烷烃标样的Rt;Rt后—后面烷烃标样的Rt。

2.4 分析方法

在同一固相微萃取和GC-MS分析条件下，比较三种不同涂层的纤维头所得到的总离子流色谱图，选择最佳色谱图利用岛津 QP2010所配备的NIST08.L和NIST08s.L自动检索，选取质谱匹配度高的前6种物质的KI值，将质谱匹配度和KI值匹配度最高的化学结构确定为该物质的化学结构。无KI值匹配性和无文献KI值可参照且质谱匹配度低的成分均定为未知物质，未列于表中。部分化合物通过标准样品的质谱图和保留时间进行确认。单个化合物的相对百分含量用总峰面积归一化后，用其峰面积的相对百分比来表示。

3 结果与分析

3.1 纤维头的选择

在其它条件恒定情况下，本实验比较了通过三种不同涂层的纤维头聚丙烯酸酯(PA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)所萃取的糖蜜草挥发性成分的GC-MS分析结果如图1所示，发现PDMS/DVB萃取头对糖蜜草挥发性成分吸附能力最强，因此本实验选用PDMS/DVB涂层纤维萃取头。

3.2 糖蜜草挥发性成分分析

按上述试验方法和条件对糖蜜草挥发性成分进行气相色谱-质谱分析，计算机质谱数据系统检索得到相似度高的化合物，然后根据计算的保留指数值以及标准样品保留时间鉴定了33个化合物，按照峰面积归一化法确定了各成分的相对含量，结果见表1。鉴定出的33个化合物占色谱总馏分出峰面积的90.94%，主要为烷烃(55.06%)以及单萜或倍半萜烯类(26.89%)化合物。邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯应该是由于使用parafilm封口膜而引入的外源污染物。

图1 PA、PDMS和PDMS/DVB三种纤维头所吸附的挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of the volatile compounds by PA，PDMS and PDMS/DVB fibers

表1 糖蜜草主要挥发性成分及其相对含量Table 1 Composition of the volatile constituents from M.minutiflora

2 5 2 0.7 3 3 正十六烷H e x a d e c a n e 9 5 1 6 0 0 0.8 9 2 6 2 1.1 4 2 柏木脑C e d r o l 9 5 1 6 1 8 1.2 7 2 7 2 3.2 4 2 正十七烷H e p t a d e c a n e 9 8 1 7 0 0 1.1 3 2 8 2 3.3 9 2 降植烷N o r p h y t a n e 9 7 1 7 0 6 1.8 0 2 9 2 5.1 2 5 苯甲酸苄酯A s c a b i n 9 5 1 7 7 1 1.0 9 3 0 2 5.9 4 2 正十八烷O c t a d e c a n e 9 6 1 8 0 0 0.5 9 3 1 2 6.2 1 7 植烷P h y t a n e 9 7 1 8 3 0 1.1 1 3 2 2 7.9 0 8 邻苯二甲酸二异丁酯I s o b u t y l p h t h a l a t e 9 8 1 8 7 8 1.5 8 3 3 3 0.5 8 3 邻苯二甲酸二丁酯B u t y l p h t h a l a t e 9 8 1 9 6 5 0.3 2

4 讨论

糖蜜草在乌干达和肯尼亚等地已被应用于Push-Pull害虫防治策略，它对钻蛀性害虫驱避作用明显［9］。Kimani等对该植物挥发性成分进行了GC和GC-MS分析，共鉴定了16个化合物［5］，部分化合物与该研究得到化合物不同，这可能与挥发物的采集方法、分析条件以及植物生境的不同等因素有关。糖蜜草通过气相色谱耦合触角电位仪(GC-EAG)以及GC-MS分析发现其挥发性萜烯类成分(E)-ocimene、α-terpinolene、β-caryophyllene、humulene、(E)-4，8-dimethyl-1，3，7-nonatriene、α-cedrene对玉米楷夜蛾(B.fusca)和班禾草螟(C.partellus)有电位反应［10］。不同于前人采用的吸附剂吸附方法［5］，本研究采用固相微萃取技术采集挥发物，分析鉴定出了更多的挥发性成分，对于它们对水稻螟虫大螟和二化螟的行为反应及其作用机制仍需进一步的探讨。寄主植物通过植物挥发物与昆虫发生化学联系，它能调节害虫的行为反应使其处在利于自身生长发育的生境条件下，这些挥发物为人类提供安全、无公害的防虫治虫新途径，也必将在未来的绿色农业生产中发挥重要的作用。

1 Wheat CW，Vogel H，Wittstock U，et al.The genetic basis of a plant-insect coevolutionary key innovation.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:20427-20431.

2 Gordon-Weeks R and Pickett JA.Plant-derived Natural Products.New York:Springer，2009.321-347.

3 Du JW(杜家纬).Plant-insect chemical communication and its behavior control.Acta Phytophysiol Sin(植物生理学报)，2001，27:193-200.

4 Landis DA，Wratten S，Gurr M.Habitat management to conserve natural enemies of arthropod pests in agriculture.Annu Rev Entomol，2000，45:175-201.

5 Kimani SM，Chhabra SC，Lwande W，et al.Airborne volatiles from Melinis minutiflora P.BeauV.，a non-host plant of the spotted stem borer.J Essent Oil Res，2000，12:221-224.

6 Khan ZR，Ampong-Nyarko K，Chiliswa P，et al.Intercropping increases parasitism of pests.Nature，1997，388:631-632.

7 Gohole LS，Overholt WA，Khan AR，et al.Effects of molasses grass，Melinis minutiflora volatiles on the foraging behavior of the cereal stemborer papasitoid，Cotesia sesamiae.J Chem Ecol，2003，29:731-744.

8 Van Den Dool H，Kratz PD.A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gasliquid partition chromatography.J Chromatogr，1963，11: 463-471.

9 Cook SM，Khan ZR，Pickett JA.The use of push-pull strategies in integrated pest management.Annu Rev Entomol，2007，52:375-400.

10 Khan ZR，Pickett JA，Berg JVD，et al.Exploiting chemical ecology and species diversity:stem borer and striga control for mazie and sorghum in Africa.Pest Manag Sci，2000，56:957-962.

Analysis of Volatile Compounds from Melinis minutiflora by HS-SPME-GC-MS

GAO Guang-chun，ZHENG Xu-song，XU Hong-xing，LV Zhong-xian*
Institute of Plant Protection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agriculture Science，Hangzhou 310021，China

In this study，a head-space solid phase microextraction(HS-SPME)method was developed for extracting the volatile compounds from Melinis minutiflora.Then gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)coupled with retention indicator and comparison with standard samples was used to characterize the components of the volatile compounds.Then the relative proportion of each component was calculated by the peak area normalization method.The results showed that Polydimethylsiloxane/divinybenzene(PDMS/DVB)SPME fibers based on the number of peaks performed well for extracting volatile compounds from M.minutiflora.Thirty-three compounds were obtained which accounted for 90.94%of the total peak areas with alkanes and terpenes as the dominant components.This study lays the foundation for developing M.minutiflora as the repellent plant for rice stem borer in terms of effective pest prevention.Also，it is the ground work for applying the evading volatiles to the rice field.

Melinis minutiflora;SPME;GC-MS;volatile constituents

1001-6880(2011)06-1073-04

2010-02-23 接受日期:2010-06-13

农业部公益性行业科研专项;水稻螟虫防治技术研究(200803004);浙江省优先主题:稻田农药减量增效安全使用关键技术(2008C1207-2)

*通讯作者 E-mail:luzxmh2004@yahoo.com.cn

S345.1;Q946.91

A