牛奶菜中黄酮类成分的研究

胡 慧，吴意轩，何祥久

武汉大学药学院，武汉430072

牛奶菜中黄酮类成分的研究

胡 慧，吴意轩，何祥久*

武汉大学药学院，武汉430072

从牛奶菜(Marsdenia sinensis Hemsl)根中分离得到6个黄酮类化合物，经光谱分析确定其结构为:芹菜素(1)，(2S)-柚皮素(2)，木犀草素(3)，异牡荆素(4)，8-C-β-D-Glucopyranosyl apigeninidin(5)，5，7-二羟基色原酮(6)。所有化合物均为首次从该植物中分离得到，同时对分离得到的单体化合物进行细胞毒活性测试，化合物1～5均表现出较强的细胞毒活性。

牛奶菜;活性成分;细胞毒活性

牛奶菜(Marsdenia sinensis Hemsl)为萝藦科牛奶菜属植物，分布在我国浙江、江西、湖北、湖南、福建、广东、广西、四川等地区。全株能壮筋骨、健骨利肠;根能舒经活络行气止痛;果实能止咳定喘［1］。其化学成分的研究较少，目前报道主要有三萜类化合物［2，3］。为了进一步探索其活性成分，我们对牛奶菜根进行了化学成分的研究，从中分得了6个黄酮类化合物，根据理化常数和波谱数据，分别鉴定为芹菜素(apigenin，1)，(2S)-柚皮素(naringenin，2)，木犀草素(luteolin，3)，异牡荆素(isovitexin，4)，8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin(5)和5，7-二羟基色原酮(5，7-dihydroxychromone，6)。这6个化合物均首次从该植物中分离得到。

1 仪器和材料

Bruker AV-400型核磁共振光谱仪;Bruker Esquire 2000型质谱仪;半制备HPLC:岛津LC-9A高效液相色谱仪，配备Shimadzu SPD-6AV型检测器，Shimadzu CTO-6A型柱温箱;RE 52CS-1型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);B-260型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。Sephadex LH-20(Pharmacia公司);ODS(Pharmacia公司);D-101大孔吸附树脂(西安蓝晓科技有限公司);柱层析用硅胶(100～200目、200～300目)和薄层色谱硅胶GF254均为青岛海洋化工厂生产。其它试剂均为国产分析纯。

ALB-124电子天平(Acculab Sartius Group);低速离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂);CHS-213生物倒置显微镜(日本Olympus公司);超净工作台(苏州实验仪器厂);TC2323型二氧化碳培养箱(美国SHELLAB公司);全自动立式高压消毒锅(武汉国光医疗仪器厂);微量加样器(Gilson公司产品)。

人肝癌细胞株HepG2、人白血病细胞株(HL-60及Mata)购自武汉大学细胞保藏中心;高糖DMEM培养粉(Sigma公司产品);胎牛血清(杭州四季青公司产品);胰蛋白酶(武汉科瑞生物技术公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma公司产品);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)。

牛奶菜根购自安徽亳州，经武汉大学药学院何祥久教授鉴定为Marsdenia sinensis。

2 提取与分离

8 kg牛奶菜根用70%乙醇加热回流提取3次，每次2 h，提取液合并减压浓缩得浸膏。将浸膏分散于蒸馏水中，依次以氯仿及水饱和的正丁醇萃取，回收溶剂后得到氯仿部位浸膏85 g，正丁醇部位浸膏152 g。

氯仿部位进行硅胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯(50∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1)，合并洗脱液为15部分。第13部分经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，0∶1)洗脱，再经Sephadex LH-20柱层析，以氯仿-甲醇(7∶3)洗脱，得到化合物1(103.2 mg)。第12部分经反复硅胶柱、Sephadex LH-20及制备HPLC分离纯化得到化合物6(10.5 mg)。正丁醇部位经D-101大孔树脂吸附，以水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇和丙酮梯度洗脱，得到7个部分。70%乙醇部分经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，0∶1)梯度洗脱，得到14个部分，第3部分(0.23 g)经硅胶柱层析，以环己烷-乙酸乙酯为洗脱剂，得到化合物2(16.7 mg)。第6部分经反复开放和中低压ODS柱层析，以甲醇-水梯度洗脱，得到化合物3(51.1 mg)。大孔树脂30%乙醇洗脱部分经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇梯度洗脱，得到化合物5(15.5 mg)和4(23.2 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:6.19(1H，d，J=0.9 Hz，H-6)，6.48(1H，d，J=0.9 Hz，H-8)，6.78(1H，s，H-3)，6.93(2H，d，J=8.6 Hz，H-3'，5')，7.93(2H，d，J=8.6 Hz，H-2'，6')，10.57(2H，brs，7，4'-OH)，12.97(1H，s，5-OH)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:164.2(s，C-2)，102.8(d，C-3)，181.7(s，C-4)，157.3(s，C-5)，98.8(d，C-6)，163.7(s，C-7)，93.9(d，C-8)，161.4 (s，C-9)，103.6(s，C-10)，121.1(s，C-1')，128.4(d，C-2')，115.9(d，C-3')，161.1(s，C-4')，115.9(d，C-5')，128.4(d，C-6')。从NMR数据可以看出化合物1为黄酮类化合物，1H NMR显示B环为4'-羟基取代，A环有2个酚羟基取代。其NMR数据与文献［4］报道的芹菜素数据基本一致，故鉴定化合物1为芹菜素(5，7，4'-三羟基黄酮，apigenin)。

化合物2 白色粉末，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)δ:12.21(1H，s，5-OH)，9.70(1H，s，OH)，8.60(1H，s，OH)，7.41(2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，6.91(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，5.97(1H，d，J=1.6 Hz，H-6)，5.96(1H，d，J=1.6 Hz，H-8)，5.48(1H，dd，J=13.0，3.0 Hz，H-2)，3.16(1H，dd，J =13.0，17.1 Hz，H-3a)，2.71(1H，dd，J=17.1，3.0 Hz，H-3b)。13C NMR(100 MHz，Acetone-d6)δ:80.3 (d，C-2)，43.9(t，C-3)，197.6(s，C-4)，165.7(s，C-5)，97.2(d，C-6)，167.7(s，C-7)，96.2(d，C-8)，164.8(s，C-9)，103.6(s，C-10)，131.2(s，C-1')，129.4(d，C-2')，116.6(d，C-3')，159.1(s，C-4')，116.6(d，C-5')，129.4(d，C-6')。从NMR可以看出化合物2为黄酮类化合物，1H NMR显示B环为4'-羟基取代(δ 6.91，3'，5'-H;δ7.41，2'，6'-H)，另外A环还含有2个酚羟基取代。根据H-2和H-3的化学位移及偶合常数，确定C-2为S构型，提示此化合物为二氢黄酮。其NMR数据与文献［5，6］报道的(2S)-柚皮素数据基本一致，故鉴定化合物2为(2S)-柚皮素(naringenin)。

化合物3 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.99(1H，s，5-OH)，7.42(1H，dd，J= 2.2，8.2 Hz，H-6')，7.41(1H，d，J=2.2 Hz，H-2')，6.90(1H，d，J=8.2 Hz，H-5')，6.68(1H，s，H-3)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.9 (s，C-2)，102.9(d，C-3)，181.7(s，C-4)，161.5(s，C-5)，98.9(d，C-6)，164.2(s，C-7)，93.9(d，C-8)，157.3(s，C-9)，103.7(s，C-10)，121.5(s，C-1')，113.4(d，C-2')，145.8(s，C-3')，149.7(s，C-4')，116.0(d，C-5')，119.0(d，C-6')。从NMR可以看出化合物3为黄酮类化合物，其NMR数据与文献［7］报道的木犀草素数据基本一致，故鉴定化合物3为木犀草素(luteolin)。

化合物4 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:13.56(1H，s，H-5)，10.46(2H，br s，H-4'，7)，7.92(2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，6')，6.92(2H，d，J =8.8 Hz，H-3'，5')，6.79(1H，s，H-3)，6.51(1H，s，H-8)，4.57(1H，d，J=9.8 Hz，H-1'')，4.04(1H，t，J =9.8 Hz，H-2'')，3.11～3.21(3H，m，H-3''，H-4''，H-5'')，3.39(1H，m，H-6'')，3.67(1H，d，J=11.1 Hz，H-6'')。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.5 (s，C-2)，102.8(d，C-3)，181.9(s，C-4)，156.2(s，C-5)，108.9(s，C-6)，163.5(s，C-7)，93.7(d，C-8)， 161.2(s，C-9)，103.4(s，C-10)，121.1(s，C-1')，128.4(d，C-2')，116.0(d，C-3')，160.6(s，C-4')，116.0(d，C-5')，128.4(d，C-6')，73.1(d，C-1'')，70.6(d，C-2'')，78.9(d，C-3'')，70.2(d，C-4'')，81.5(d，C-5'')，61.5(t，C-6'')。由NMR可以看出化合物4为黄酮苷类化合物，7.92(H-2'，6')，6.92 (H-3'，5')为B环上的AA'BB'偶合系统，4'位有羟基取代。13C NMR中δ 78.9、73.1、70.6、70.2、81.5和61.5六个信号为β-葡萄糖的信号，结合HMBC谱可以确定此葡萄糖与黄酮C-6位为C-C连接。其NMR数据与文献［8］报道的异牡荆素(isovitexin)数据基本一致，故鉴定化合物4为异牡荆素(isovitexin)。

化合物5 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:13.18(1H，s，5-OH)，10.42(2H，br s，H-4'，7)，6.79(1H，s，H-3)，6.27(1H，s，H-6)，8.03 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，4.68(1H，d，J=10.0 Hz，H-1'')，3.82(1H，m，H-2'')，3.25(1H，m，H-3'')，3.35(1H，m，H-4'')，3.28(1H，m，H-5'')，3.77(2H，m，H-6'')。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:164.0(s，C-2)，102.4(d，C-3)，182.1(s，C-4)，160.4(s，C-5)，98.1(d，C-6)，162.5(s，C-7)，104.6(s，C-8)，156.0 (s，C-9)，104.0(s，C-10)，121.6(s，C-1')，129.0(d，C-2')，115.8(d，C-3')，161.1(s，C-4')，115.8(d，C-5')，129.0(d，C-6')，73.3(d，C-1'')，70.8(d，C-2'')，78.7(d，C-3'')，70.6(d，C-4'')，81.8(d，C-5'')，61.2(t，C-6'')。由1H和13C NMR可以看出化合物5为一黄酮苷类化合物，δ 8.03(H-2'，6')和δ 6.88(H-3'，5')为B环上的AA'BB'偶合系统，可以确定 B环为 4'单取代苯环，δ 13.18为 5-OH，δ 10.42为一宽峰(2H，7-OH，4'-OH)。13C NMR中δ 73.3、70.8、78.7、70.6、81.8和61.2六个信号为β-葡萄糖的信号，与化合物4的13C NMR谱比较，可以确定此葡萄糖与黄酮C-8位C-C键连接。结合文献［9］可以确定化合物 5为 8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin。

化合物6 黄色粉末，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.69(1H，s)，8.15(1H，d，J=6.0 Hz，H-2)，6.24(1H，d，J=6.0 Hz，H-3)，6.15(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.31(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:157.3(d，C-2)，110.4 (d，C-3)，181.1(s，C-4)，161.6(s，C-5)，99.3(d，C-6)，165.6(s，C-7)，94.2(d，C-8)，157.9(s，C-9)，104.5(s，C-10)。在1H NMR中，在δ 8.15(1H，d，J =6.0 Hz)氢信号和δ 6.24(1H，d，J=6.0 Hz)处的氢信号形成AB自旋偶合系统，δ 6.31(1H，d，J= 2.0 Hz)氢信号和δ 6.15(1H，d，J=2.0 Hz)氢信号分别为色原酮8位和6位AX自旋偶合系统的两个芳香质子信号。δ 12.69(1H，s)信号为5位羟基质子信号。结合文献［10］可以确定化合物6为5，7-二羟基色原酮(5，7-dihydroxychromone)。

4 活性测试结果

采用MTT法测定所得化合物的抗肿瘤活性，用Calclusyn软件计算出半数抑制浓度(IC50)。活性测试结果见表1。

表1 化合物的抗肿瘤IC50值Table 1 IC50values of antiproliferative activity of the compounds isolated from M.sinensis

活性测试结果表明，部分单体化合物表现出较强的抑制肿瘤细胞增殖活性。化合物1、2和3对HepG2细胞的抑制作用较为明显。化合物4和5对HL-60细胞的抑制作用较强，而对HepG2细胞无明显抑制作用。所测试化合物对Mata细胞均表现出一定的抑制作用。

牛奶菜同属植物乌骨藤的制剂具有较好的抗癌作用，已经广泛用于临床。我们前期研究表明，牛奶菜提取物具有较好的抑制癌细胞增殖作用。从牛奶菜中分离得到的黄酮类化合物显示出一定的抗癌作用，进一步验证了牛奶菜的潜在抗癌作用，这些化合物的抗癌作用机制有待进一步研究。

致谢:感谢武汉大学药学院实验中心邱国福老师代测所有核磁共振波谱。

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Flavonoids from the Roots of Marsdenia sinensis Hemsl

HU Hui，WU Yi-xuan，HE Xiang-jiu*
College of Pharmacy，Wuhan University，Wuhan 430072，China

Six flavonoids were isolated from the roots of Marsdenia sinensis Hemsl.Their structures were identified by spectroscopic analysis as apigenin(1)，naringenin(2)，luteolin(3)，isovitexin(4)，8-C-β-D-glucopyranosyl apigeninidin(5)，and 5，7-dihydroxychromone(6).All these compounds were obtained from the plant for the first time，and their cytotoxicities were evaluated.Compounds 1-5 had relatively high cytotoxicities.

Marsdenia sinensis Hemsl;active constituents;cytotoxicities

1001-6880(2011)06-1045-04

2010-05-26 接受日期:2010-07-07

留学回国人员科研启动基金项目

*通讯作者 Tel:86-27-68759923;E-mail:hexiangjiu@whu.edu.cn

R284.1

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