槲皮素固体脂质纳米粒的包封率与载药量测定Δ

常明泉，黄良永，叶立红，袁胜浩，安志斌，王刚（湖北医药学院附属太和医院，十堰市442000）

槲皮素固体脂质纳米粒的包封率与载药量测定Δ

常明泉＊，黄良永，叶立红，袁胜浩，安志斌，王刚#（湖北医药学院附属太和医院，十堰市442000）

目的：建立槲皮素固体脂质纳米粒（SLN）的包封率和载药量测定方法。方法：采用高速离心-高效液相色谱法。色谱柱为DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45），流速为1.0mL·min-1，检测波长为254nm，柱温为30℃。结果：槲皮素检测浓度在2.0～200.0µg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.9996）；平均回收率为97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。该条件下，槲皮素SLN的包封率为80.2%，载药量为1.7%。结论：所建方法便捷、可靠，可用于SLN包封率与载药量的测定。

槲皮素；固体脂质纳米粒；包封率；载药量

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，它在一些植物药如芦丁、槐米、红枣、桑叶、三七中以苷的形式存在；它通过细胞增殖和血管新生相关信号通路的复杂作用而对肿瘤表现出化学预防作用[1]。固体脂质纳米粒具有细胞亲和性、靶向性、缓释性、低毒性和稳定性的特点，药物制成脂质体可大大提高生物利用度[2]。槲皮素固体脂质纳米粒是十堰市武当中医药研究所研制的一种抗癌新制剂，为了更好地发挥槲皮素的药理作用，控制制剂质量，笔者拟用高速离心机和高效液相色谱（HPLC）法对其包封率和载药量进行测定。

1 仪器与试药

TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪子华仪器制造厂）；UPS-200H型超声波震荡仪（功率：500W，工作频率：50Hz，南京熊猫电子仪器有限公司）；3000型HPLC仪（美国戴安公司）。

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406）；槲皮素原料（十堰市武当中医药研究所，批号：20100414）；山嵛酸甘油酯、大豆卵磷脂、胆固醇、泊洛沙姆、聚乙二醇2000（武汉祥和精细化工有限公司，批号分别为100305、100310、100305、100315、100307）；丙酮（武汉市江北化学试剂厂，批号：20080407）；氯仿（洛阳化学试剂厂，批号：20080224）；吐温80（上海化学试剂厂，批号：20081006）；无水乙醇（武汉市洪山中南化学试剂有限公司，批号：20091106）；甲醇、乙酸均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 槲皮素固体脂质纳米粒的制备[3]

分别称取山嵛酸甘油酯0.1g、胆固醇0.1g、大豆卵磷脂0.2g置适宜烧杯中，于80℃水浴中熔融作为油相；称取丙酮6mL、氯仿6mL混匀，再称取槲皮素20mg加入丙酮-氯仿混合液中混合溶解作为有机相；将有机相与油相混合均匀，保温75℃；称取泊洛沙姆0.1g、聚乙二醇20000.1g、吐温801mL、纯化水13mL置适宜烧杯中，于75℃水浴上加热溶解作为水相；在磁力搅拌状态下（600r·min-1）用带有6号针头的适宜注射器吸取油相缓缓注入水相中（2mL·min-1），继续搅拌120min乳化包封，至浓缩到原体积的1/2时，将烧杯移入另一盛有2℃冰水的磁力搅拌器中，加入13mL约2℃的冰水，继续搅拌固化60min，即得。

2.2 槲皮素固体脂质纳米粒包封率与载药量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱：DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：20μL[4～7]。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取于105℃减压干燥至恒重的槲皮素对照品2.0mg，加无水乙醇超声溶解，定容至10mL的容量瓶中，即得。

2.2.3 样品溶液的制备 （1）样品溶液A的制备：取槲皮素固体脂质纳米粒样品1g，精密称定，置50mL平底烧杯中，加无水乙醇约15mL超声破乳分散均匀，溶液转入50mL容量瓶中，洗涤烧杯3次（10、10、10mL），洗液并入容量瓶中，定容，摇匀，取混合溶液适量于离心机中以1.6×104r·min-1的速度离心15min，取上清液用0.45µm微孔滤膜过滤，即得。（2）样品溶液B的制备：取同一批号样品1g，加入15mL纯化水，按上述方法用同体积的纯化水处理样品，即得。（3）阴性样品溶液的制备：按样品溶液A的方法精密称取不含槲皮素的阴性样品1g，加入无水乙醇照上述方法处理，即得。

2.2.4 标准曲线的制备 分别吸取槲皮素对照品溶液0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇稀释，即得2、40、80、120、160、200μg·mL-1的对照品溶液，精密吸取 20μ L进样，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，重复操作3次。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，检测浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝1.3435c－1.4904（r＝0.9996，n＝6）。结果表明，槲皮素检测浓度在2.0～200.0μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.5 系统适用性试验 分别吸取对照品溶液和各样品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样。结果，对照品溶液、样品溶液A、样品溶液B均在相同位置有吸收峰出现，阴性样品溶液则无吸收，说明其他辅料对槲皮素测定不产生干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.样品溶液A；C.样品溶液B；D.阴性样品溶液；1.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample solution A；C.sample solution B；D.negative sample solution；1.quercetin

2.2.6 精密度试验 取浓度为80μg·mL-1的对照品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样5次，测定槲皮素的峰面积。结果，RSD＝1.12%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取取已知含量的样品溶液适量，于温度为5～10℃的冰箱中保存，分别于0、4、12、24、36、48h取样，进样测定槲皮素的含量。结果，RSD＝1.62%（n＝6），表明供试品溶液在48h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 取已测知含量的槲皮素固体脂质纳米粒样品6份，每份0.5g，精密称定，分别加入浓度为80.0μg·mL-1的对照品溶液1mL，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定槲皮素的含量，计算加样回收率。结果，平均回收率为97.83%，RSD＝1.03%（n＝6）。

2.2.9 重复性试验 平行称取6份样品，各1g，按“2.2.3”项下方法制备样品溶液，照上述色谱条件进样测定。结果，RSD＝1.80%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.10 包封率的测定 在“2.2.1”项色谱条件下，分别对样品溶液A和样品溶液B进样测定槲皮素的含量，可以计算出纳米粒中槲皮素的总量和游离槲皮素的量，按下式计算出纳米粒的包封率：包封率＝（W总－W游）/W总×100%（式中，W总为脂质体中槲皮素总量；W游为脂质体中未被包封的游离槲皮素量）。测得该制剂包封率为80.2%。

2.2.11 载药量的测定 按上述方法，分别测定出样品溶液A和样品溶液B中槲皮素的含量，按下式计算载药量：载药量＝（W包－W游/V总重）×100%（式中，V总重为纳米粒取样量；W包为脂质体中被包封的槲皮素量；W游同前）。测得该制剂的载药量为1.7%。

3 讨论

本试验采用乳化蒸发-低温固化法制备槲皮素固体脂质纳米粒，主药槲皮素不溶于水，先将其加入丙酮-氯仿（1∶1）组成的有机相中溶解后再加入油相中混合，加入2.5%的吐温80作乳化剂，以山嵛酸甘油酯、胆固醇为载体材料，乳化温度控制在75℃，乳化和固化时搅拌器转速均控制在600r·min-1，制得的脂质纳米粒稳定性好，并有较高的包封率。

本试验采用高速离心-HPLC法测定固体脂质纳米粒的包封率和载药量，在处理样品溶液A时，加入无水乙醇超声不仅能够破乳而且使槲皮素被乙醇充分溶解；处理样品溶液B时，在样品中加入纯化水，超声分散、洗脱未被包封的槲皮素，超声时间应控制在15～30min内，时间过久超声波的空化效应由于对粒子的粉碎作用会使纳米粒中的槲皮素破乳而游离，影响测定结果。

[1] 舒 毅，谭 陶，张思宇，等.槲皮素的药理学研究进展[J].华西药学杂志，2008，23（6）：689.

[2] 崔福德.药剂学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，1980：421-426.

[3] 张 红.柚皮苷固体脂质纳米粒包封率及体外释放度测定[J].中国药师，2010，13（3）：318.

[4] Pugund LN，Enge LA，Vandhana RS，et al.Switchgrass water extracts：extraction，separation and biological activity of rutin and quercetin[J].J Agric Food Chem，2009，57（17）：7763.

[5] 乐文清.HPLC法测定丹皮酚脂质体药物含量与包封率[J].安徽医药，2010，14（4）：417.

[6] 郑庆中，刘利军，白晓朝.氧化苦参碱脂质体的制备及其质量评价[J].中国药房，2007，18（10）：756.

[7] 黄义昆，张志荣，杜 鹃.盐酸川芎嗪脂质体的研制及质量评价[J].中国药房，2004，15（6）：51.

Determination of Drug-loading Rate and Encapsulation Efficiency of Quercetin Solid Lipid Nanoparticles

CHANG Ming-quan，HUANG Liang-yong，YE Li-hong，YUAN Sheng-hao，AN Zhi-bin，WANG Gang（Taihe Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To establish the determination method of the drug-loading rate and encapsulation efficiency of Quercetin solid lipid nanoparticles（QUE-SLNs）.METHODS：A high-velocity centrifuge-HPLC was adopted.The determination was performed on DiamonsiL-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-4.3%acetic acid solution（55∶45）at flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm and column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of quercetin was 2.0～200.0µg·mL-1（r＝0.9996）with an average recovery of 97.83%（RSD＝1.03%，n＝6）.The encapsulation efficiency of QUE-SLNs was 80.2%and the drug-loading rate was 1.7%.CONCLUSION：The method is simple，convenient and reliable.It can be used for the determination of drug-loading rate and encapsulation efficiency of SLN.

Quercetin；Solid lipid nanoparticles；Encapsulation efficiency；Drug-loading rate

R284.2；R283.62

A

1001-0408（2011）27-2525-02

Δ湖北省教育厅科研项目（Q20102110）

＊主管药师。研究方向：药物制剂。电话：0719-8801103。E-mail：cmqman@yahoo.com.cn

#通讯作者：副主任药师，博士。研究方向：中药药理。E-mail：wangan139@163.com

2010-11-03

2011-04-10）