响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺

徐金龙，张红梅，徐秀泉（.江苏中兴药业有限公司，镇江市22009；2.江苏大学药学院，镇江市2203）

响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺

徐金龙1＊，张红梅1，徐秀泉2#（1.江苏中兴药业有限公司，镇江市212009；2.江苏大学药学院，镇江市212013）

目的：采用响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺。方法：固定提取时间，以乙醇浓度、料液比、提取温度为响应因子，总黄酮得率为响应值，采用3因素3水平的响应面分析法优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺参数。结果：各因素对总黄酮提取率的影响大小依次为料液比＞提取温度＞乙醇浓度；牡丹皮总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，提取温度55℃，料液比1∶40（W/V），在此条件下，牡丹皮总黄酮得率为3.11mg·g-1。结论：试验结果与模型预测值相符，该工艺可用于牡丹皮中总黄酮的提取。

牡丹皮；总黄酮；响应面分析法；提取工艺

牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，性微寒，有清热、凉血、活血、消瘀的功能，用以治疗热入血分、吐血、阑尾炎初起、跌打损伤等[1]。牡丹皮酚是其主要活性成分，具有抗菌消炎、抗过敏、增强细胞免疫功能、抗肿瘤、抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化、保肝利尿等多种药理作用[2～4]。近年来研究人员从牡丹皮中分离得到黄酮类化合物[5]，其中槲皮素、儿茶素、山柰素是清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、O2－自由基，抑制酪氨酸酶、高级糖化物终末产物（AGES）产生的主要活性成分[6，7]，但对牡丹皮中总黄酮的提取工艺研究国内、外鲜见报道。本研究采用乙醇作为提取溶剂，选取乙醇浓度、提取温度、料液比3个因素，采用响应面设计优化牡丹皮中总黄酮的提取工艺，以期为牡丹皮的深入开发与应用提供依据。

1 仪器与试药

UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；DHG-9145鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；BS110S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）。

牡丹皮（购自江苏镇江九泰医药有限公司，经江苏大学沈绛英副主任药师鉴定为毛茛科芍药属植物牡丹的干燥根皮，干燥、粉碎过16目筛，备用）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306）；药用乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均购自国药集团。

2 方法

2.1 牡丹皮总黄酮含量测定

2.1.1 标准曲线的制备 精密称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品10.9mg，加70%乙醇溶解并定容至50mL，得218μg·mL-1芦丁对照品溶液。量取该对照品溶液 0、1、2、3、4、5、6mL，置于25mL量瓶中，分别加入5%NaNO2、AlNO3各1mL，NaOH 10mL，每种试剂滴加间隔5min，最后用70%乙醇定容至25mL，于510nm波长处测定吸光度。以进样浓度（c）对吸光度（A）进行线性回归，得回归方程为A＝0.0107c－0.008（r＝0.9996，n＝7）。结果表明，芦丁进样浓度在8.72～52.32μg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.1.2 牡丹皮总黄酮的提取及其含量测定 准确称取牡丹皮粉末1g，加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度的水浴中提取30min，离心后按“2.1.1”项下方法测定样品吸光度，并按下式计算总黄酮得率：总黄酮得率＝（A－0.008）/0.0107×稀释倍数/1000/M（式中，M是所取牡丹皮的量（g）；A是吸光度）。

2.2 单因素试验

根据经验，考察乙醇浓度、料液比、提取温度3个因素对牡丹皮中总黄酮得率的影响，试验结果见图1。由结果可知，随着乙醇浓度的提高，黄酮类物质得率也增加，在乙醇浓度为60%时达到峰值，高于60%后，得率有较大程度下降，这可能由于牡丹皮中黄酮类化合物多为苷类物质，具有较强的极性，根据相似相溶原理，在60%左右的乙醇中溶解度较大的缘故；料液比为1∶40时的提取效果较好，提高料液比例，总黄酮得率略有增大，考虑节省溶剂消耗，选择料液比为1∶40；在低于60℃的范围内随着温度的升高总黄酮得率随之升高，说明较高的温度对黄酮类化合物的溶出是有利的，当超过60℃后，总黄酮得率变化不大，有下降的趋势，这可能是由于在较高温度下，溶剂挥发严重加之其他物质也随之溶出的缘故。各因素对牡丹皮中总黄酮得率的影响见图1。

图1 各因素对牡丹皮中总黄酮得率的影响A.乙醇浓度；B.料液比；C.提取温度Fig 1 Effect of yeild rate of total flavoniods of various factorsA.enthanol concentration；B.sample solvent ratio；C.extraction temperature

2.3 响应面分析法优选提取工艺

2.3.1 试验安排与结果 根据中心组合设计原理，结合响应面分析方法，综合单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）3个因素为自变量，总黄酮得率为响应值，设计3因素5水平共17个试验点（其中14个为析因试验，3个为中心试验）的响应面分析试验。对乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、提取温度（X3）按下列公式进行编码：X1＝（X1－60）/20，X2＝（X2－30）/10，X3＝（X3－50）/10。响应面因素水平编码见表1；响应面分析试验结果见表2。

表1 响应面因素水平编码Tab 1 Factors and levels code of response surface

表2 响应面分析试验结果Tab 2 Results of response surface methodology

2.3.2 模型方程的建立与方差分析 应用Design-Expert 7.1.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到乙醇浓度（X1）、料液比（X2）、提取温度（X3）与牡丹皮总黄酮之间的二次多项回归方程：Y＝2.89+0.06X1+0.21X2+0.15X3－0.055X1X2+0.075X1X3－0.038X2X3－0.32X12－0.082X22－0.12X32。对上述回归模型进行方差分析，结果见表3（表中，＊＊＊表示P＜0.001，差异极显著；＊＊表示P＜0.01，差异高度显著；＊表示P＜0.05，差异显著）。

由表3可知，一次项中料液比（X2）、提取温度（X3）对总黄酮得率的线性效应极显著，乙醇浓度（X1）对总黄酮得率的线性效应高度显著，各因素对总黄酮得率的影响大小为X2＞X3＞X1；二次项中乙醇浓度（X1）、提取温度（X3）对总黄酮得率的线性效应极显著，料液比（X2）对总黄酮得率的线性效应高度显著；交互项中乙醇浓度与料液比（X1X2）、乙醇浓度与提取温度（X1X3）对总黄酮得率的线性效应显著。模型的调整确定系数为0.9720，说明该模型能够97.2%反映相应值随自变量的变化，模型拟合程度较好。在本试验设计范围内，回归方程的失拟项检测P＝0.4089＞0.05，不显著；回归方程显著性检测P＜0.0001，极显著，证明应用响应曲面法优化的提取工艺提取牡丹皮总黄酮是可行的。

2.3.3 响应曲面分析 提取过程中，各因素对总黄酮得率影响的二维等高线和三维响应曲面见图2。

表3 牡丹皮总黄酮得率方差分析结果Tab 3 Variance analysis of yeild rate of total flavoniods of P.suffruticosa

图2 各因素对牡丹皮总黄酮得率影响的二维等高线和三维响应曲面图A.乙醇浓度与料液比；B.乙醇浓度与提取温度；C.料液比与提取温度Fig 2 Response surface and contour plots for the effects of variables on the rate of the total flavonoids from P.suffruticosaA.ethanol concentration and ratio of material to liquid；B.ethanol concentration and extraction temperature；C.ratio of material to liquid and extraction temperature

由图2可知，提取温度和料液比能够显著促进总黄酮的溶出，表现为随温度和料液比的升高，总黄酮得率提高；随乙醇浓度的增加，总黄酮得率先升高后降低，说明黄酮类化合物具有一定的极性，根据相似相溶原理，只有在一定浓度的乙醇中才能够最大程度溶出。

2.3.4 提取工艺条件的确定 为验证牡丹皮总黄酮提取模型方程的适用性，对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即3个主要因素的最佳水平值，分别为：X1＝0.06、X2＝1.00、X3＝0.49，转换后得到提取的最佳条件为：乙醇浓度61.2%、料液比1∶40（W/V），提取温度54.9℃，预测牡丹皮总黄酮得率为3.05mg·g-1。为方便试验，调整方案为乙醇浓度60%，料液比1∶40（W/V），提取温度55℃，重复试验3次，计算牡丹皮总黄酮得率，求其平均值为3.11mg·g-1。实际测得与预测的总黄酮得率较为接近，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面分析方法适用于牡丹皮总黄酮提取工艺的优化。

3 讨论

响应面分析法采用多元二次回归的方法，将多因子试验中因子指标的相互关系用多项式近似拟合，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，已经越来越多地应用于各种生物处理过程的优化[8]。在前期单因素试验的基础上，采用响应面分析法对牡丹皮总黄酮的提取工艺条件进行优化，可较准确的预测试验结果，使试验从设计到结果分析都准确、可靠，可见响应面分析法是优化中药提取工艺的有效方法。

[1] 胡红宇，杨 郁，于能江，等.牡丹皮化学成分研究[J].中国中药杂志，2006，31（21）：1793.

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Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids from Paeonia suffruticosa by Response Surface Methodology

XU Jin-long，ZHANG Hong-mei（Jiangsu Zhongxing Pharmaceutical Limited Company，Zhenjiang 212009，China）XU Xiu-quan（College of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total flavonoids from Paeonia suffruticosa by response surface methodology.METHODS：The extraction time was fixed，the parameters of extraction technology of total flavonoids from P.suffruticosa were optimized by three factors and three levels response methodology using ethanol concentration，ratio of material to liquid and extraction temperature as the response factors and with yeild rate of total flavonoids as response value.RESULTS：The effects of factors in the descending order were as follows：ratio of material to liquid，extraction temperature and ethanol concentration.The optimal extraction technology was as follows：ethanol concentration 60%，extraction temperature 55℃，and ratio of material to liquid 1∶40（W/V）.Under these conditions the maximal yield of total flavonoids reached 3.11mg·g-1.CONCLUSION：The results are agreed with model predictions.The technology can be used as the extraction process of total flavonoids from P.suffruticosa.

Paeonia suffruticosa；Total flavonoids；Response surface methodology；Extraction technology

R284.2；R283

A

1001-0408（2011）27-2536-03

2010-09-05

2010-12-26）