黄花铁线莲化学成分阿魏酸对类风湿关节炎的治疗作用

涂院海，杨晓军

(延安大学附属医院风湿病科，陕西 延安 716000)

黄花铁线莲化学成分阿魏酸对类风湿关节炎的治疗作用

涂院海，杨晓军

(延安大学附属医院风湿病科，陕西 延安 716000)

目的研究延安本地植物黄花铁线莲化学成分阿魏酸在类风湿关节炎治疗中的药用价值。方法通过硅胶和凝胶柱色谱分离，利用多种波谱技术鉴定黄花铁线莲，获得5种化合物，将其中的有效成分阿魏酸进行动物急性毒性实验及抗炎活性实验。结果化合物阿魏酸无急性毒性反应，并且具有良好的抗炎活性。结论延安本地生长植物黄花铁线莲所提取化学成分阿魏酸具有良好的抗炎活性，对类风湿关节炎有很好的药用价值。

黄花铁线莲(ChematisintricataBunge)；阿魏酸；抗炎活性；类风湿关节炎

黄花铁线莲(ChematisintricataBunge)是我国北方各省普遍生长的，毛莨科铁线莲属野生草本植物，别名狗豆蔓、萝萝蔓，商品名透骨草。具有祛风除湿、活血止痛、消肿作用[1]。民间常有用鲜草捣烂外敷治疗关节、软组织肿痛。为了进一步挖掘中草药在类风湿关节炎治疗中的有效途径，提高临床疗效、减少西药带来的不良反应，为最终进入临床应用研究奠定理论基础。作者收集位于延安山区的野生植物黄花铁线莲全草，通过硅胶和凝胶柱色谱分离，利用多种波谱技术鉴定化学结构，获得5种化合物，选择其中3种成分，分别进行了动物急毒实验和抗炎活性实验，结果3种成分均未发现急性毒性反应，且均具有良好的抗炎消肿作用。本文仅对第三种化学成分阿魏酸(动物实验编号KSHT-I)进行动物急毒及抗炎活性实验做重点报道，探讨对类风湿关节炎的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

XRC-1型显微熔点仪；Pekin-Elmer 983G型红外光谱仪(KBr压片)；Bruck-AR×500型核磁共振仪(TMS内标)；MAT-711型质谱仪；VarioEL有机元素分析仪；SephadexLH-20(Pharmacia产品)；柱层析硅胶(100～200目)青岛海洋化工厂产品(PIHAO)：黄花铁线莲全草采自陕西省甘泉县，由延安大学生命科学院刘世鹏老师鉴定。

1.2 提取和分离

新鲜全草晾干20 kg，用70%的乙醇常温下浸泡5 d，将提取液减压浓缩得暗黑色浸膏。将该浸膏混悬于水中，依次用石油醚(6℃～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物经柱层析分离(氯仿-甲醇梯度洗脱)，共得化合物：1号(3505 mg)，2号(1872 mg)，3号(2123 mg)，4号(45 mg)，5号(59 mg)。

结构鉴定：所得化合物3:(动物实验编码KSHT-1):白色针晶(甲醇)，m.p.172℃～173℃，IR(KBr)cm-1:3431(-OH)，3020～2502(宽峰)，1690(羧C=O)，1627，1516(C=C)。ESI(+)-MS显示准分子离子峰m/z195[M+H]；元素分析得碳、氢的百分含量分别为61.80、5.17；质谱和元素分析推出该化合物的分子式C10H10O4，相对分子质量：194。1HNMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:3.83(3H，s)，6.35(1 H，d，J=15.6 Hz，H-8)，6.76(d，J=8.0 Hz，H-5)，7.08(dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6)，7.28(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.50(d，J=15.6 Hz，H-7);13CNMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:55.6(-OCH3)，112.3(C-2)，115.4(C-5)，115.7(C-6)，122.8(C-8)，125.7(C-1)，144.3(C-7)，147.8(C-4)，149.1(C-3)，167.7(C-9)。其理化数据与文献对照基本一致[5]，故鉴定为阿魏酸。

2 动物实验

2.1 急毒实验

2.1.1 实验目的 分组后，在24 h内给药2次，观察小鼠接受过量所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性实验设计剂量、分析毒性作用的靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、临床剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。

2.1.2 实验条件 动物品系：昆明种小鼠体重18～22 g，♀♂各半，由第四军医大学实验动物中心提供，二级动物，合格证号NO：0034180，许可证号：SCXK-(军)2007-007。本实验在二级动物室进行，实验动物购回后适应性喂养一周后进行试验，实验动物分组后标记样品名称、实验动物种类、性别及组别。净化室温度保持在20℃～25℃；相对湿度保持在45%-70%。

2.1.3 受试药物名称 KSHT-I—阿魏酸。来源：延安大学附属医院。批号：20110501

配制：最大受试药物量实验：取200 mg阿魏酸加色拉油至6 ml，浓度33.3 mg/ml，呈乳色泛黄液体.

实验方法：取小鼠40只，♀♂各半，体重18～22 g，随机分为正常对照组及给药组，每组各20只小鼠，给药前禁食12 h，给药组以33.3 mg/ml浓度的KSHT-I乳悬液，按0.4 ml/10g灌胃，每天2次灌胃给药，对照组给与同体积色拉油，连续观察14 d，详细记录小鼠行为活动、状态、饮食、大小便及毛色、分泌物等。

2.1.4 实验结果 给药后，小鼠大便正常呈湿润颗粒状，无死亡，活动自如，进食、饮水均正常，皮毛光洁，口、鼻、眼及肛门清洁无分泌物，连续观察两周，体重有增加，给药前体重、第7日、第14日体重见表1，给药组体重与对照组体重无显著性差异。解剖所见：胸腔与腹腔未见异常液体，肠管未见胀气，心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见颜色、形态异常，没有出血点或其它病理改变，胃粘膜颜色红润，无出血点或溃疡，尸检无异常。

2.1.5 实验结论 KSHT-I给昆明种小鼠灌胃未测出LD50，24 h内给药2次，观察14 d，小鼠无死亡，也无明显中毒反应。其最大受试药物量为2664 mg/kg，在此剂量下未观察到KSHT-I的急性毒性反应。结果见表1。

表1 KSHT-I急毒小鼠体重

注：给药组与对照组比较P>0.05

2.2 抗炎活性实验

KSHT-I实验组通过叉菜胶致大鼠足跖肿胀及二甲苯致小鼠耳肿胀，利用药物复方七叶皂苷钠乳膏做对比，观察KSHT-1外涂致炎部位对肿胀的减轻程度。

2.2.1 试验材料

(1)受试药物：：KSHT-I—阿魏酸。来源：延大附属医院。批号：20110501。

(2)阳性药物：复方七叶皂苷钠凝胶，国药准字H20020168，批号：20100953，规格：20 g/支，有效期至2012年8月，山东绿叶制药有限公司生产。

(3)仪器及试剂：天平，型号：1012-PT，精密度为0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产；足趾容积测量仪，型号：YLS-7A，山东医科大学生产；微量加样器。

(4)配制：取100 mg加香油至3 ml，浓度33.3 mg/ml，呈乳色泛黄液体。

(5)动物：ICR小鼠，SD大鼠，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号：NO：0003240，许可证号：SCXK(陕)2007-001。

(6)试验方法及结果

剂量设置：

小鼠：大剂量每鼠耳涂100 μl，小剂量每鼠耳涂50 μl。小鼠体重按20 g计，即大剂量5 ml/kg(166.5 mg/kg)，小剂量2.5 ml/kg(83.25 mg/kg)。

大鼠：大剂量每鼠足涂0.4 ml，小剂量每鼠足涂0.2 ml。大鼠体重按100 g计，即大剂量4 ml/kg(133.2 mg/kg)，小剂量2 ml/kg(66.6 mg/kg)。

2.2.2 KSHT-I对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

按文献方法[1]取SD大鼠40只，体重80～110 g，雌雄各半。随机分为4组，每组10只。分别为模型对照组、阳性对照组(复方七叶皂苷钠凝胶)、KSHT-I大、小剂量组。每鼠采用足趾容积测量仪测量标记位置以下的右后肢的容积(ml)，作为致炎前正常值，然后，分别在大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶混悬液0.1 ml/只致炎。即可涂药：大剂量组每鼠右后肢足跖皮肤涂0.4 ml，小剂量组每鼠右后肢足跖皮肤涂0.2 ml，阳性对照组每鼠右后肢足跖皮肤涂0.4 ml。致炎即给药后1 h，采用足趾容积测量仪测量标记位置以下的右后肢的容积(ml)，以后每隔1h用以上方法测右后肢足跖容积，共测量5 h。并计算肿胀度，肿胀度=给药后足容积(ml)-给药前足容积(ml)，各组与模型对照组比较，组间进行t检验。结果见表2。

表2可见，与模型对照组比较，阳性对照组、本品133.2 mg/kg组从致炎后1～5 h，能明显抑制角叉菜胶致大鼠足跖肿胀。提示，KSHT-I对化学性炎症有抑制作用。

2.2.3 KSHT-I对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

按文献[2]方法，取健康ICR小鼠10只，体重18～22 g，雌雄各半，随机分为4组，每组10只。分别为模型对照组，阳性对照组(复方七叶皂苷钠凝胶)，KSHT-I大、小剂量组。给小鼠右耳前后两面涂二甲苯约50 μl，左耳做正常对照。即可涂药：大剂量组每小鼠右耳前后两面皮肤涂100 μl，小剂量组每小鼠右耳前后两面皮肤涂50 ul，阳性对照组每小鼠右耳前后两面皮肤涂100 μl。致炎即给药后1 h后，将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳，用9 mm打孔器在左右耳同一位置打孔，电子天平上称重，右耳重量减去左耳重量为肿胀度，肿胀度除以左耳重量乘以100即为小鼠耳肿的肿胀百分率，组间比较，t检验。结果见表3。

从表3可以看出，KSHT-I大组剂量组能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀。提示本品对急性炎性有一定的抑制作用。

表2 KSHT-I对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

注：与模型对照组相比较*P<0.05，**P<0.01

表3 KSHT-I对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01

3 结果

黄花铁线莲中提取化合物阿魏酸通过动物急毒实验，均无明显的毒性反应，给药组与对照组比较P>0.05。通过小鼠和大鼠耳重实验和足跖肿实验，与复方七叶皂苷钠乳膏模型对照组对比，有良好的抗炎消肿作用。与对照组比较分别给药组与对照组比较P<0.05和P<0.05。

4 讨论

在科学飞速发展，技术不断进步的时代，如何挖掘中医药潜力，利用现代科学技术发展中医药研究，保留和发展祖国医药传统，更好地为人类健康服务。风湿病牵扯多学科领域，病因复杂，病程长，多器官损害，晚期致残，常伴有骨关节肿痛[2]。临床治疗对于改善症状、控制病情、恢复功能和保护多脏器不受损害，是临床医生难于顾全的疑难问题。通过对黄花铁线莲提取的化学成分阿魏酸进行了动物急毒实验和抗炎活性实验，结果证明，未发现急性毒性反应，且具有良好的抗炎活性。

阿魏酸(Ferulic acid)即4-羟-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸，分子量为194。具有抗血小板聚集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素a2(txa2)的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作用[3].研究表明阿魏酸是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分[4]。从黄花铁线莲中提取尚未见报道。

中医对黄花铁线莲(透骨草)药用价值有所描述：能祛风湿，舒筋活血，止痛[5]。外敷治疗风湿病及关节炎、腰腿痛、颈椎病等，但是局部皮肤易出现水泡不良反应。透骨草有多种植物，黄花铁线莲具有抗炎和镇痛活性[6]。将提纯化学成分阿魏酸单体化合物进行动物活性实验或研究应用于风湿病临床尚未查到报道。这次提纯化学成分阿魏酸的动物急毒、抗炎活性研究结果表明，植物黄花铁线莲提纯的单体化合物阿魏酸在类湿病治疗方面有较高的药用价值，并消除了局部起水泡的不良反应，为进一步开发体内用药研究提供了有利依据，有可能成为有效、低毒、无内脏损害的治疗类风湿关节炎的理想药物。到底阿魏酸的抗炎活性作用原理是否与抑制(NTF-a、白介素等)那些致炎因子有关，有待进一步研究。

[1]中医研究院中药研究所，中国医学科学院药物研究所，卫生部药品生物制品检定所，等.全国中草药汇编[M].第2版，北京:人民卫生出版社出版，2009.

[2]蒋明，朱立平，林孝义。风湿病学[M].北京：科学出版社出版，1996.

[3]胡益勇，徐晓玉.阿魏酸的化学和药理研究进展[J].中成药，2006(2):1-14.

[4]宋志宏，赵玉英，段京莉.黄花铁线莲化学成分研究[J].中国中药杂志，1995，20(10):613-614.

[5]宋志宏，张桂兰，李艳梅，等.黄花铁线莲的化学成分研究[J].天然产物开发与研究杂志，1997(6):11-16.

[6]王璇，蔡少青，陈虎彪，等.来源于铁线莲属透骨草的鉴别研究[J].中国中药杂志，1998，23(4)，198-254.

R931

A

1672-2639(2011)04-0022-03

延安市科技项目(2008KS)

2011-10-21；责任编辑徐文梅]