IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

卫巍 徐凌 王锋 何珊珊 杨丽娟 郭传勇 王兴鹏

·论著·

IRX1在胰腺癌中的表达及其启动子区甲基化状态

卫巍 徐凌 王锋 何珊珊 杨丽娟 郭传勇 王兴鹏

目的检测胰腺癌的易洛魁族同源盒基因(IRX1)的表达及其启动子区的甲基化状态，探讨两者间的相关性。方法采用实时PCR法检测12例胰腺癌组织及6株胰腺癌细胞株的IRX1 mRNA表达。基因序列分析IRX1基因启动子区结构。应用甲基化抑制剂5- 氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理胰腺癌细胞，采用甲基化特异性PCR(MSP)、非甲基化特异性PCR(USP)及实时PCR检测处理前后IRX1启动子甲基化状态和IRX1 mRNA表达。结果胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11，显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌细胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均显著低于人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)。IRX1基因启动子区富含CpG岛。各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化，经5-Aza-dC处理后甲基化状态得以逆转，IRX mRNA的表达也得以恢复。结论胰腺癌的IRX1mRNA表达下降，与其IRX1基因启动子区CpG岛高甲基化状态相关。

胰腺肿瘤； 启动子； 甲基化； IRX1

易洛魁族同源盒(iroquois homeobox, IRX)基因最早在果蝇的神经系统发育研究中被发现，编码一个含高度保守同源盒序列的三氨基酸环延伸(three amino acid extension, TALE)超家族蛋白[1-2]。人类IRX家族成员共有6种，根据染色体的定位分为两簇，其中IRX1基因位于5号染色体短臂5p15.33区，该区域在多种肿瘤中均存在不稳定性[3-5]。 IRX1在头颈项肿瘤和胃癌的研究中常表达降低[6]，并与肿瘤的形态学和临床表型存在一定相关性。本研究测定胰腺癌、癌旁组织及各胰腺癌细胞株中该基因的表达水平，分析IRX1基因调控区的甲基化状态，为阐明其在胰腺癌发生及进展过程中的分子作用机制提供一定的实验依据。

材料与方法

一、材料

人胰腺癌细胞株AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990为本实验室保存，常规培养，传代。待细胞生长到指数阶段时用终浓度为0.5 μmol/L的5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理5 d，以未干预的细胞作为对照组，收集各组对数生长期细胞。12例胰腺癌及癌旁正常组织为上海第十人民医院保存的经病理证实的2006年至2009年间手术切除标本。应用Trizol试剂(上海英骏生物技术公司)抽提细胞及组织总RNA；应用酚氯仿法常规抽提各细胞株基因组DNA。

二、方法

1．实时PCR法测定IRX1 mRNA表达：应用Primer Express 3.0软件设计引物。IRX1引物序列上游 5′-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3′，下游5′-CCC-CGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3′，扩增片段120 bp；内参β-actin引物序列上游 5′-CTGGAACGGTGA-AGGTGACA-3′，下游5′-AAGGGACTTCCTGTAACA-ATGCA-3′，扩增片段140 bp。引物序列由上海生工生物工程公司合成。运用ABI7900HT PCR仪进行实时PCR，反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60℃ 1 min，35个循环，所得数据经2-ΔΔCt处理后进行分析[7]。

2．IRX1基因结构分析：利用NCBI数据库的Splign分析IRX1基因的序列；Ensemble数据库分析IRX1转录本的5′-upstream序列，寻找启动区的典型结构；MethPrimer软件分析启动子区CpG岛的状况。

3．IRX1基因调控区CpG岛甲基化状态分析：采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)和非甲基化特异性PCR(unmethylation-specific PCR,USP)法检测。取500 ng纯化DNA进行亚硫酸氢盐修饰。MethPrimer软件设计IRX1启动子CpG岛MSP及USP引物。MSP上游5′-GTTGTT-ATTAGCGTTTAGGTCGTC-3′，下游5′-ATCTAACAC-CGAATTTACAATTTCG-3′，扩增片段127 bp；USP上游5′-TTGTTATTAGTGTTTAGGTTGTTGG-3′，下游5′-CTATCTAACACCAAATTTACAATTTCAC-3′，扩增片段128 bp。选用Hotstar Taq酶进行反应，反应条件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 1 min，35个循环。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织及细胞株的IRX1 mRNA表达

胰腺癌组织IRX1 mRNA的表达量为0.31±0.11，显著低于癌旁正常胰腺组织的1.05±0.32(P<0.01)。胰腺癌细胞AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990的IRX1 mRNA表达量分别为0.36±0.08、0.34±0.16、0.37±0.11、0.25±0.06、0.31±0.04、0.36±0.02，均显著低于对照组的人肾上皮293细胞的1.03±0.28(P<0.05或<0.01)，其中PANC1细胞的表达最低。

二、IRX1基因结构

IRX1基因由4个不同大小的外显子构成，仅存在一种转录本模式，其转录起始点(transcription start site，TSS)上游的启动子区GC含量高达60%以上，存在多个CpG位点，长度超过600 bp(图1)。

图1 IRX1基因序列分析图

三、各胰腺癌细胞株IRX1基因调控区CpG岛甲基化状态

各胰腺癌细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有甲基化，其中PANC1和PaTu8988两株细胞USP条带几乎不可见(图2)。

M: MSP；U: USP；1: AsPC1; 2: BxPC3；3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

图2胰腺癌细胞株IRX1基因调控区的甲基化状态

四、5-Aza-dC处理后各胰腺癌细胞株IRX1基因调控区CpG岛甲基化状态及IRX1 mRNA表达的变化

经5-Aza-dC处理后，各胰腺癌细胞株的IRX1基因启动子区CpG岛甲基化程度均有大幅降低(图3)；AsPC1、BxPC3、Capan-2、PANC1、PaTu8988和SW1990细胞IRX1 mRNA表达量分别为3.04±0.53、2.24±0.39、2.26±0.28、2.43±0.26、2.64±0.97、1.79±0.05，均较未处理组的1.02±0.22、1.02±0.21、1.04±0.33、1.06±0.46、1.00±0.08、1.02±0.23显著上调(P<0.05或<0.01)。

M: MSP; U: USP; 1: AsPC1; 2: BxPC3; 3: Capan-2; 4: PANC1; 5: SW1990; 6: PaTu8988

图35-Aza-dC处理后胰腺癌细胞株IRX1基因启动子区CpG岛甲基化状态

讨 论

胰腺癌作为病死率最高的人类肿瘤之一，其发生进展是一个涉及多种基因的多阶段、多步骤的复杂的生物学过程[8]。DNA甲基化是其中一种精确的调控方式，是真核细胞正常而普遍的修饰方式，是哺乳动物表达调控的主要表遗传学形式，是将基因型与表型联系起来的一条纽带[9-10]。研究表明，遗传表型改变，特别是抑癌基因启动子区域内CpG岛出现异常甲基化而失活参与了部分胰腺癌的发生过程[11]。目前认为启动子区CpG岛高甲基化可能引起转录抑制，因此DNA启动子区域的甲基化被看作是肿瘤抑制基因失活的主要机制[12]。

本实验结果显示，胰腺癌组织及各胰腺癌细胞

株中IRX1 mRNA表达水平均较正常胰腺组织显著降低。通过对IRX1基因序列分析，发现该基因启动子区GC含量较高，并存在一个长度超过600 bp的CpG岛，我们推测IRX1基因CpG岛的高甲基化可能是导致其表达下调的主要原因。为此，本研究检测各胰腺癌细胞株中IRX1基因的甲基化状态，结果显示所有6株肿瘤细胞株IRX1基因启动子CpG岛对应位点均有不同程度的甲基化。应用5-Aza-dC处理后，IRX1基因的甲基化得到逆转，IRX1 mRNA的表达得到很大程度的恢复，证实异常甲基化是胰腺癌中抑癌基因IRX1失活的机制之一。

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2010-11-04)

(本文编辑：吕芳萍)

ExpressionandmethylationofIroquoishomeoboxprotein1inpancreaticcancer

WEIWei,XULing,WANGFeng,HEShan-shan,YANGLi-juan,GUOChuan-yong,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiTenthPeople′sHospital,TongjiUniversity,Shanghai200072,China

WANGXing-peng,Email：wangxingpeng@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Iroquois homeobox protein 1 (IRX1) gene and the hypermethylation status of its promoter in pancreatic cancer, and their relationship.MethodsReal-time PCR was used to quantitatively detect IRX1 gene expression level of 12 sets of resected pancreatic cancer tissue and 6 sets of pancreatic cancer cell lines; gene sequences analysis was used to detect the structure of IRX1 promoter; DNA methylation inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-dC) was used in pancreatic cancer cell lines, and then the methylation of IRX 1 was measured by methylation-specific PCR (MSP) and unmethylation sequence-PCR (USP) methods.ResultsExpression of IRX1 mRNA in pancreatic cancer tissue was 0.31±0.11, which were significantly lower than that in normal pancreatic tissue (1.05±0.32,P<0.01). IRX1 mRNA expression of AsPC1, BxPC3, Capan 2, PANC1, PaTu8988 and SW1990 were 0.36±0.08, 0.34±0.16, 0.37±0.11,0.25±0.06, 0.31±0.04, 0.36±0.02, which were significantly lower than that in human kidney epithelial 293 cells (1.03±0.28,P<0.05 or <0.01). Analysis of IRX1 gene sequence showed abundant CpG islands in promoter. Hypermethylation of IRX1 promoter site was found in all pancreatic cancer cell lines. However, its methylation status could be reversed by 5-Aza-dC, and the IRX1 expression was also restored.ConclusionsIRX1 mRNA expression is down-regulated in pancreatic cancer, and it is related with promoter CpG islands hypermethylation.

Pancreatic neoplasms； Promoter； Methylation； IRX1

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.05.002

国家自然基金(81072065)；上海市科委基金(08411963000, 09410705400)

200072 上海，同济大学附属第十人民医院肝胆胰内科

王兴鹏，Email：wangxingpeng@hotmail.com