脂酶非均相催化反应生物传感器的研究

齐 颖 陈晓慧 关 茵 常云鹤 于殿宇

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

脂酶非均相催化反应生物传感器的研究

齐 颖 陈晓慧 关 茵 常云鹤 于殿宇

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

研究固定化脂肪酶在生物传感器上的响应，研制了能将脂肪酶催化底物所产生的电子转移过程转换为电流信号输出的电化学生物传感器，酯酶非均相反应体系温度为65℃，pH为7.7时验证脂酶活性的变化规律。测定反应体系电流强度的变化趋势为首先是平稳，反应开始电流逐渐增大，随着甘二酯逐渐增多，电流变化缓慢;当甘一酯的量逐渐增多电流也变大，反应结束电流趋于平稳。用液相色谱仪跟踪测定反应过程中底物的含量，结果显示测量相对误差仅为4.9%。证明利用脂酶非均相催化反应生物传感器测定酶催化底物反应的程度是可行的，为实现计算机连续在线检测提供了理论基础。

生物传感器 脂肪酶 非均相 电流 相对误差

随着科学技术的发展，生物传感器已经成为生物质技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法，具有较高的选择性和灵敏度［1］。

生物传感器是一种特殊的器件或装置［2］，应用的是生物机理，与传统的化学传感器和离线分析技术相比，具有高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、能在复杂体系中进行快速在线监测等优点［3］。基本工作原理是:当底物的分子质量发生变化时，会有相应的阴阳离子生成，将生物敏感元件发生的特异性反应及信号经由物理元件——换能器，转变为光、电、声等易检测信号，从而可将反应程度用离散或连续的数字信号表达出来［4］，间接地获知待测物的有关信息。现在所用的生物元件包括抗原或抗体、酶或基质、各种酶的混合体、整个细胞或部分细胞、植物或动物组织和神经受体［5］。目前生物传感器主要应用于食物、农业、生物技术、药物和军事领域［6］。

研究以固定化脂肪酶Novozym 435作为生物元件，以一级稻米油为反应底物的非均相反应，研制了能将脂肪酶催化底物所产生的电子转移转换为电流输出的电化学生物传感器。

固定化脂肪酶生物传感器能够将脂肪酶的专一性、灵敏性和电学的简便、迅速巧妙地结合起来，可以在一个复杂的体系中，不受其他物质干扰，快速准确测出某些物质的含量，并可监测酶与底物反应的程度。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

磷酸二氢钾(分析纯):天津市化学试剂三厂;磷酸氢二钠(分析纯):天津市鑫铂特化工有限公司;氢氧化钠(分析纯):天津市光复科技发展有限公司;铁氰化钾(分析纯):上海江莱生物科技有限公司;去离子水:娃哈哈集团有限公司。

ML 54电子分析天平、FE20 pH计:梅特勒－托利多仪器有限公司;DK－2000－IIIL恒温水浴锅:天津市泰斯特仪器有限公司;C655－μA电流表:哈尔滨三达德电力技术有限公司;YHW1104远红外恒温干燥箱:天津北华仪器厂;L535－1低速离心机:北京医用离心机厂;圆柱形石墨(底面半径×高=0.5 cm×7 cm):中银(宁波)电池有限公司;1100液相色谱仪:安捷伦科技有限公司;离子交换膜:凯瑞化工有限责任公司;敞口玻璃容器(长×宽×高×厚度=20 cm×10 cm×10 cm×1 cm):订制;铂片(长 ×宽=5 cm ×2 cm)、铂丝:市售。

1.2 原料

Novozym 435:北京高瑞森科技有限公司;一级稻米油:黑龙江省北大荒米业有限公司。

图1 脂肪酶催化三酰甘油水解的反应过程

1.3 试验方法

2、制作讲课文字底稿。语言应当口语化、专业化，描述问题准、让授课对象听得懂，尽量避免书面语言，并对稿件熟读记忆。在授课中，教师讲到理论性的内容时，以及使用过于理论化的语言讲授课程时，课程内容变得枯燥，学员听课难度加大。尽量使用口语化的表述、接地气的表述，学员听课的障碍就会小很多。但是，这不意味着词语的滥用，机具的专业术语仍应该规范地使用，体现严谨的态度。特别是PPT课件，在突出图片、减少文字的背景下，更要注意语言的精炼。

1.3.1 磷酸缓冲溶液(PBS)的制备

分别精确称取磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.36 g和1.42 g，用200.0 mL 去离子水配制成浓度为 0.1 mol/L的缓冲液，配制3组，再用氢氧化钠将缓冲液pH调到7.7，用pH计测试;用去离子水将铁氰化钾配成过饱和溶液，待用。

1.3.2 测试样品的制备

量取稻米油3 mL，再精确称取固定化脂肪酶Novozym 4 350.09 g，待用。

1.3.3 固定化脂肪酶Novozym 435生物传感器装置的设计及试验方法

脂肪酶催化三酰甘油水解的反应过程如图1。固定化脂肪酶生物传感器装置的原理框图如图2。

图2 固定化脂肪酶生物传感器原理框图

首先不加任何测试样品，测量装置中的电流强度;然后将测试样品稻米油3 mL和固定化脂肪酶Novozym 4 350.09 g快速混匀，置于阴极室内进行测试。测量溶液pH为7.7时的电流强度，每隔1 h记录1次电流表示数。反应结束后，将酶、底物和缓冲溶液的混合液放入低速离心机内离心，离心后将酶置于恒温干燥箱内干燥，进行回收再利用。

在试验进行到7 h和16 h的时候分别取样20次，用液相色谱仪测定样品中的成分，并通过液相色谱验证试验的准确性［7］。

2 结果与分析

不加任何测试样品时的电流强度为8.12 μA。酶与底物比3%，反应温度65℃，缓冲溶液pH 7.7，反应时间25 h的电流输出结果如图3。

从图3可以看出:电流强度随着时间的变化而变化，在温度为65℃，验证脂酶在pH为7.7时活性的反应过程变化规律。测定反应体系电流强度的变化趋势为首先是平稳，随着反应进行，电流逐渐增大，甘二酯逐渐增多，电流变成平稳，随着甘一酯的增加电流再增大，然后平稳。用液相色谱仪跟踪测定反应过程中底物的含量，结果显示测量相对误差仅为4.9%。这可能是因为固定化脂肪酶Novozym 435与底物反应，首先是催化三酰甘油生成甘二酯，在达到平衡的时候反应停止一段时间，然后酶继续催化甘二酯生成甘一酯，最后达到平衡。

图3 缓冲溶液pH为7.7时的电流强度

从图4～图6可以看出，在反应分别为7 h和16 h的时候，经液相色谱仪测得样品中甘一酯和甘二酯的含量，证明7 h时，样品中基本上只含有甘二酯，而在16 h时，样品中基本上只含有甘一酯。经过重复试验20次，测得的相对误差仅为4.9%，从而验证了试验的准确性。

图6 反应16 h时测得样品的液相色谱图

3 结论

固定化脂肪酶Novozym 435生物传感器装置可以将固定化脂肪酶Novozym 435催化底物反应所发生离子浓度变化转换为电流强度进行输出，通过在不同pH条件下脂酶催化反应产生的电流不同，验证了脂酶活性的变化规律。此装置能够将固定化脂肪酶Novozym 435的专一性、灵敏性和电学迅速、巧妙地结合起来，并可监测酶与底物反应的程度，判断反应终点，液相色谱仪测得样品中甘一酯和甘二酯的含量，经重复试验20次，相对误差仅为4.9%。

本生物传感器装置的设计为实现连续在线检测提供了基础前提，通过优化反应体系工艺参数并确定参数采集方法，将采集的电信号放大并进行数据处理，可实现反应中各关键控制点的动态设置和显示、数据修改、故障诊断与自动报警，实现计算机在线优化控制，评价生物传感器可用信度。

［1］周祖新，郭晓明，王根礼，等.乙酰胆碱酯酶生物传感器的研究［J］.农药，2008，47(8):577 －579

［2］何星月，刘之景.生物传感器的应用［J］.物理学和高新技术，2003，32(4):249 －252

［3］陈俭霖.生物传感器在环境监测中的应用及发展前景［J］.污染防治技术，2006，19(3):59 －62

［4］何东海.利用乙酰胆碱酯酶生物传感器监测海水中有机磷农药［D］.青岛:中国海洋大学，2004

［5］胡小艳.新型酪氨酸酶生物传感器研制［D］.无锡:江南大学，2008

［6］Roe J N.Biosensor development.Pharmaceutical Research.1992，9(7):835 －844

［7］孟祥河，章银军，毛忠贵.甘油酯的分析方法［J］.中国油脂，2004，29(1):44 －46.

Study on Biosensor of Heterogeneous Reaction Conjugated by Lipase

Qi Ying Chen XiaohuiGuan Yin Chang Yunhe Yu Dianyu
(School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

In order to study immobilized lipase responded in biosensor，it had developed an electrochemical biosensor which could transform the electron metastasis processes produced by lipase－conjugated substrate to current signal output，and the electron metastasis of the lipase in the lipase heterogeneous reaction system was verified at 65 ℃，pH 7.7.The trends in current intensity of reaction was determined as follows:it was stable firstly，then gradually increased with the reaction starting，and then changed slowly along with the increase of monoglyceride;when monoglyceride gradually increased，current also became greater，and the current became stable when reaction was to the end.Liquid chromatography was used to determine the content of the substrate of the reaction.The results showed that the relative error was only 4.9%.It proved that it was feasible to determine the extent of the reaction conjugated by enzyme with the biosensor of lipase heterogeneous conjugating reaction，so as to provide a basic premise for realizing the continuous detection on－line by a computer.

biosensor，lipase，heterogeneous，electric current，relative error

TP212.3

A

1003－0174(2011)11－0102－04

863计划(2010AA101503)

2011－01－17

齐颖，女，1985年出生，硕士，粮食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，大豆油脂加工技术