木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的研究

吴 非 于胜男 葛锡娟 王 鹏 李 良

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的研究

吴 非 于胜男 葛锡娟 王 鹏 李 良

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

以大豆分离蛋白为原料，以细胞生长抑制率为指标，用木瓜蛋白酶对其进行酶解，得到大豆抗癌活性肽。木瓜蛋白酶的最佳作用条件为:温度55℃、酶添加量7 000 U/g、反应pH 7.5、底物质量分数6%、酶解时间4 h。在抗癌活性肽制备过程中，对水解度和肽活性之间的关系进行了研究。结果表明，水解度与大豆肽的抗癌活性不呈线性关系。用10 000 u和5 000 u的超滤膜处理木瓜蛋白酶的酶解产物，在不同分子质量的超滤组分中，分子质量小于5 000 u组分的癌细胞生长抑制率最高，达32.58%。

大豆抗癌活性肽 制备 木瓜蛋白酶

大豆含有35%～40%的蛋白质，是食物蛋白的一种重要来源［1］。大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶作用后，再经过特殊处理所得到的蛋白质分解物。国内对大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血压性、降血脂和降胆固醇方面［2－5］，有关大豆抗癌活性肽的报道较少。前期研究结果表明，大豆多肽也具有抗癌活性［6］。

癌症是当今发病率最高的疾病，严重危害人类健康。目前我国癌症患者已超过750万，每年约有130多万人死于癌症，而且其发病率和死亡率还在逐年递增［7］。合成的抗癌药物虽能有效地控制疾病，但同时它也具有造成免疫系统损伤、骨髓受抑制等副作用［8］，因而，研究食品源的抗癌活性肽具有十分重要的意义。我国是大豆的主产国，大豆资源非常丰富［9］，为研究大豆抗癌活性肽提供了物质基础。前期研究结果表明，多种蛋白酶都可以用来制备大豆抗癌活性肽，木瓜蛋白酶的制备效果更加突出［6］。大豆抗癌活性肽具有安全性高、毒副作用小、容易吸收和易于制备等优点［10］。该论文研究结果对开发大豆抗癌活性肽产品、预防和辅助治疗疾病、促进大豆精深加工都具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料及设备

大豆分离蛋白:国家大豆工程技术研究中心。胃癌细胞7901:乳品国家重点实验室;木瓜蛋白酶:无锡杰能科生物有限公司;其他试剂均为分析纯。

快速离心机:北京医用离心机厂;凯氏定氮仪:上海新嘉电子有限公司;冷冻干燥机:上海医用离心机厂;Labscale TFF System超滤系统:Millipore;超净工作台:北京安泰;CO2细胞培养箱:上海博迅实业有限公司;倒置显微镜:日本OLYMPUS;酶联免疫检测仪:美国BIO－RAD。

1.2 试验方法

1.2.1 原料常规指标测定

蛋白质含量的测定方法按照 GB/T 5009.5—2003，水分含量的测定方法按照 GB/T 5009.3—2003，灰分的测定方法按照GB/T 5009.4—2003。

1.2.2 酶活力测定

采用福林－酚法进行测定，参照SB/T 10317—1999。

1.2.3 水解度(DH)测定

依据pH－Stat法，蛋白质水解时会释放出氨基酸使溶液的pH变化，通过滴定保持蛋白酶的最佳反应pH环境，因此，水解度可由水解过程中NaOH的消耗量来计算［11］。

式中:VNaOH为水解过程中消耗NaOH的量/mL，Mp为底物蛋白质的总量/g，NNaOH为NaOH的当量浓度/mol/L，Htot为每克蛋白质中肽键的克当量数(取7.8)，α 为氨基的解离度，1/α =1+10(pK－pH)

1.2.4 大豆肽抗癌活性的测定

采用MTT法测定大豆肽对胃癌细胞的生长抑制率［12］。

1.2.5 大豆抗癌活性肽的制备研究

配制质量分数为6%的大豆分离蛋白溶液，在90℃热处理15 min，然后，将反应条件调至木瓜蛋白酶反应的最适条件［13］，用6 000 U/g酶活单位的木瓜蛋白酶进行水解制备大豆肽。反应过程中用1 mol/L的NaOH溶液或HCl调节酸碱度，使其一直处于酶的最适反应pH值，并使温度始终保持在酶反应的最适温度。在酶解开始后2、3、4、5、6 h取水解液，在100℃条件下保温15 min使酶失活，调节pH到大豆分离蛋白等电点pI 4.5后，4 000 r/min离心15 min，取上清液测水解度。余下上清液进行冻干，取一定质量的冻干粉溶于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，溶液过0.2 μm的滤膜后，作用于胃癌细胞，测定细胞生长抑制率。以底物浓度、温度、pH、酶用量、酶解时间为因素，以癌细胞生长抑制率为检测指标，采用5因素5水平正交试验设计(见表1)，确定木瓜蛋白酶的最优反应条件。

表1 L25(55)因素水平表

1.2.6 大豆抗癌活性肽的超滤分离

将大豆分离蛋白的酶解液通过截留分子质量为10 000 u和5 000 u的聚醚砜膜，将10 000 u的超滤膜的滤过液作为5 000 u超滤膜的起始液，超滤条件为压力0.2 Mpa、pH 7.0。分别收集外液和内液，得到分子质量大于10 000 u、分子质量在10 000～5 000 u之间和分子质量小于5 000 u的3种酶解液。冻干后测定其细胞生长抑制率。

1.2.7 数据处理

原始数据的整理采用Microsoft Excel(Office 2007)软件完成;试验数据采用SAS8.1软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白的常规指标

试验所用大豆分离蛋白含蛋白质、水分、灰分分别为 90.33%、3.72%、3.04%。

2.2 蛋白酶的活力

通过绘制酪氨酸标准曲线得回归方程为Y=0.010 6x －0.002 5，R2=0.984 6。式中，x 代表酪氨酸质量浓度(g/mL)，Y代表OD值，0.984 6为标准曲线的线性相关系数。结果表明，木瓜蛋白酶活力为23 106.3 U/g。酶活性的测定对本试验十分重要，它反应了1 g酶制剂在适宜的条件下水解酪蛋白的能力。

2.3 用木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的酶解条件优化

以底物浓度、酶用量、温度、水解时间、pH为单因素进行试验，以癌细胞生长抑制率为检测指标，研究单因素对于木瓜蛋白酶酶解液抗癌活性的影响。单因素试验确定了底物质量分数、酶用量、温度、水解时间、pH 分别为 6%、7 000 U/g、55 ℃、4 h、7.5时，其对癌细胞生长抑制作用效果最佳。

表2 木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的正交试验结果

经过预试验(单因素)考虑确定了其试验因素的范围，对底物质量分数、酶用量、酶解温度、酶解时间和pH值，进行5因素5水平的正交试验设计，确定木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的最优条件，试验结果见表2。

从表2正交试验的极差分析可以看出，各因素对木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白的影响次序依次是:底物质量分数＞酶解温度＞酶用量＞反应pH＞酶解时间。反应条件最佳组合为A3B4C3D4E4，即木瓜蛋白酶制备大豆抗癌活性肽的最优作用条件为:酶解温度55℃、酶添加量7 000 U/g、反应pH 7.5、酶解时间4 h、底物质量分数6%。

2.4 大豆抗癌活性肽的细胞生长抑制率与水解度之间的关系

在木瓜蛋白酶的不同酶解时间下，测定水解度和大豆肽的细胞生长抑制率，结果见图1。

图1 细胞生长抑制率与水解度之间的关系

由图1可以看出，细胞生长抑制率与水解度之间并不呈线性关系，当水解度为20.95%时，有最大的细胞生长抑制率28.34%;当水解度继续增大时，细胞生长抑制率有所下降，而后趋于平稳。原因是随着酶解反应的进一步发生，可与酶反应的底物逐渐减少，酶切位点也逐渐减少，同时酶活性也有所降低，产物的积累对酶的作用也会产生竞争性抑制，而且已产生的有活性肽段会被进一步水解，所以，酶解产物的活性有所下降。

2.5 超滤分离大豆抗癌活性肽

将酶解液进行超滤，获得分子质量大于10 000 u、分子质量在10 000～5 000 u之间和分子质量小于5 000 u的3种大豆肽。测定其细胞生长抑制率，结果见图2。

比较分子质量大于10 000 u、10 000～5 000 u、小于5 000 u和未超滤的4种组分的癌细胞生长抑制率，结果表明，分子质量小于5 000 u的组分的癌细胞生长抑制率最高，为32.58%。通过差异性分析可知，分子质量小于5 000 u组分的癌细胞生长抑制率与其他组分的癌细胞生长抑制率差异显著。因此，选择5 000 u的超滤膜来分离木瓜蛋白酶的酶解产物。

图2 超滤获得的不同分子质量大豆肽的细胞生长抑制率比较

3 结论

3.1 以蛋白质90.33%、水分3.72%、灰分3.04%的大豆分离蛋白为底物，用活力为23 106.34 U/g的木瓜蛋白酶水解，制备大豆抗癌活性肽。木瓜蛋白酶的最佳酶解条件为:温度55℃、酶添加量7 000 U/g、反应pH 7.5、底物质量分数6%、酶解时间4 h。

3.2 水解度与大豆肽的抗癌活性不呈线性关系。水解度在4 h内上升，然后趋于稳定，而细胞生长抑制率在达到最高值后有下降的趋势。

3.3 用超滤膜处理木瓜蛋白酶制备的大豆抗癌活性肽，获得分子质量大于10 000 u、分子质量在10 000～5 000 u之间和分子质量小于5 000 u的3种组分。其中，分子质量小于5 000 u组分的癌细胞生长抑制率最高，达32.58%。

［1］李里特.大豆加工与利用［M］.北京:化学工业出版社，2003:55－59

［2］吴建中.大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究［D］.广州:华南理工大学，2003

［3］张国胜，孔繁东，祖国仁，等.大豆蛋白抗高血压活性肽的研究［J］.中国乳品工业，2004，32(8):12 －14

［4］张晓梅.降血压和降胆固醇大豆肽的分离纯化［D］.无锡:江南大学，2006

［5］禚同友，丛建民.大豆生物活性肽的制备及其生物活性研究［J］.中国酿造，2007(8):6－9

［6］吴非，于胜男，葛锡娟，等.大豆蛋白酶解物的抗癌活性研究［J］.东北农业大学学报，2010，41(12):98－102

［7］孙权，徐俊萍，许惠仙，等.大豆异黄酮抗肿瘤作用的研究［J］.食品科技，2009，34(8):60 －62

［8］单厚昌，马伟光，高中祖.我国天然抗肿瘤药物的研究进展［J］.现代中西医结合杂志，2005，14(6):825 －827

［9］左青.我国大豆加工走势探讨［J］.中国油脂，2007，32(8):16－19

［10］Gabor M，Marilena M，Annam A J.Synthesis and structural characterization ofbioactive peptide conjugates using thioether linkage approaches［J］.J Peptide Science，2004，10(5):701－713

［11］Adler Nissen.Enzymatic hydrolysis of food protein［M］.Essex:Elsevier Applied Science Publishers LTD，1986:122－144

［12］盛新华，卿三华，李镏洋.MTT、WST－8法测定细胞生长抑制率的结果比较［J］.山东医药，2006，46(6):20－21

［13］吴显荣.木瓜蛋白酶的开发与应用［J］.中国农业大学学报，2005，10(6):11 －15.

Research on Preparation of Soybean Anti－cancer Bioactive Peptide by Papain

Wu Fei Yu Shengnan Ge Xijuan Wang Peng Li Liang
(Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

In this paper， the soybean protein isolate was used as a raw material and treated by papain to obtain soybean anti－ cancer bioactive peptide，of which cell growth inhibitory value was regarded as an index.The optimal treating conditions of papain were:hydrolysis temperature 55 ℃，protease dosage 7 000 U/g，pH value 7.5，substrate concentration 6%and enzymolysis time 4 h.The relationship between degree of hydrolysis and anti－ cancer activity was studied in the preparation of anti－ cancer peptide.The results showed that cancer cell growth inhibitory value had no linear relationship with the hydrolysis degree.The hydrolysate was separated by the 10 000 u and 5 000 u ultrafiltration membrane.The part of molecular weight less than 5 000 u had the highest anti－cancer activity，up to 32.58%.

soybean anti－ cancer bioactive peptide，preparation，papain

TS214

A

1003－0174(2011)11－0094－04

哈尔滨市科技创新人才基金(2008RFQXN016)

2010－12－30

吴非，女，1968年出生，教授，博士生导师，大豆产品精深加工