外源铁蛋白基因(Pea－Fer)对稻米品质性状的影响

赵 霏 任三娟 郭泽建 吴建国 包劲松 沈圣泉

(浙江大学农业与生物技术学院1，杭州 310029)

(中国农业大学植物病理系2，北京 100094)

外源铁蛋白基因(Pea－Fer)对稻米品质性状的影响

赵 霏1任三娟1郭泽建2吴建国1包劲松1沈圣泉1

(浙江大学农业与生物技术学院1，杭州 310029)

(中国农业大学植物病理系2，北京 100094)

利用外源豌豆铁蛋白基因(Pea－Fer)的转化系Fer34及其受体亲本粳稻(Oryza sativa ssp.japanica)品种秀水11(XS11)，经过连续回交和自交，并结合GUS标记基因辅助选择技术，获得了含有Pea－Fer基因的Fer34-XS11。该纯系与原受体亲本秀水11构成一对近等基因系。以该对近等基因系为材料，研究外源铁蛋白基因(Pea－Fer)对稻米主要品质性状的影响。结果发现，在稻米外观和蒸煮食用品质方面，转基因品系的外型、垩白、透明度、糊化温度、胶稠度和直链淀粉含量等性状与对照基本相同;在稻米主要营养品质方面，转基因品系除稻米籽粒中铁含量比对照有显著增加以外，其余检测的矿质元素、蛋白质、氨基酸含量等都无显著性差异;在稻米胚乳淀粉及其结构方面，转基因品系的淀粉黏滞性(RVA谱)、米饭质地及其电镜下淀粉粒结构和排列等，均与对照相仿。可见，外源豌豆铁蛋白基因(Pea－Fer)的转入，主要提高了转基因品系稻米籽粒中的铁含量，但并未影响稻米的主要品质性状。

水稻 转基因 豌豆铁蛋白基因 蒸煮食用品质 营养品质 RVA谱 质地性 电镜

近年来，随着基因工程技术的发展，转基因技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用和迅速发展，并且已经成功培育出抗虫、抗病、抗逆、耐除草剂和改善营养品质的转基因水稻［1］。然而，外源基因的导入可能会打乱水稻原有基因组，从而影响到与导入基因不相关的稻米品质变异。这种现象在转基因植物中常有发现，诸如转基因抗虫棉的纤维品质综合性状变差，不能达到优质纤维育种的目标要求［2］;高分子质量麦谷蛋白亚基基因(HMW－GS)转基因系小麦籽粒淀粉颗粒分布发生变化，淀粉持水性上升，峰值黏度、最终黏度下降［3］;cry1AB毒蛋白导入系水稻的淀粉糊化温度升高［4］等。

在这些转基因植物中，如果研究材料属于转基因食品，那么其食用安全性则是除转基因目标功能以外最关键的品质因素。而转基因食品的主要营养成分与原亲本之间的差异程度，就是衡量转基因产品食用安全性的重要指标之一［5］。外源铁蛋白转基因水稻是一种新型营养型富铁水稻［6］，它作为特种食用稻米，其籽粒品质直接与该新品种的应用前景有关。而外源铁蛋白基因导入，虽然使得稻米籽粒中铁含量显著性提高［7－9］，但是该外源基因对转基因系水稻籽粒的品质性状是否产生直接或间接影响，迄今还少有确切研究。

尽管随着转基因技术研究深入，有关转基因植株性状变异的报道日益增多。但由于转基因当代植株及其自交后代，发生变异的原因有多重，诸如可能是转基因培养过程中非目标基因无性系变异引起的;也可能是外源基因的导入破坏了受体基因的活性，影响了受体植株的代谢过程;还可能是由于转基因表达，消耗了植株体内的部分能量，打破了原有的能量供给和平衡，造成一些性状表达所需能量的不足，使表型发生了变化［10－11］等，前者可以通过育种手段加以消除，后两者则是外源基因导入所产生的直接或间接效应。因此，要确切研究和区分外源铁蛋白基因导入水稻后，对转基因受体亲本的稻米品质性状影响，即产生或引起的外源铁蛋白基因直接效应或间接效应等，还是较为困难。

为避免由于转基因植株再生过程中可能产生的无性系变异等诸多因素引起对稳定转基因纯系稻米品质性状变异的干扰，本试验采用近等基因系研究方法［12］，即通过构建具有遗传背景基本相同、仅有一对外源铁蛋白质基因存在与否的一对近等基因系Fer34－XS11和XS11(CK)，比较两者间在稻米外观品质、蒸煮食用品质、营养品质、淀粉组成和结构及综合口感、食味等方面的异同，客观地评价外源铁蛋白基因对受体水稻的稻米品质影响，从而为转基因富铁水稻的深入研究和应用提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浙江大学生物技术研究所与本实验室合作，利用农杆菌介导法将豌豆铁蛋白基因(Pea ferritin，Pea－Fer)转化到粳稻品种秀水11中，获得大量独立转基因植株［13］;并经连续多代的自交纯化、单株选择，GUS分子检测和稻米全铁含量测定，筛选得到稻米铁含量显著高于秀水11(CK)的若干份Pea－Fer转基因系［7－9］。

本试验再以原亲本秀水11为轮回亲本，Pea－Fer转基因植株(Fer34)为非轮回亲本，采用连续回交和自交法，并结合GUS组织染色检测，在BC6F3得到了性状稳定，且带有Fer34插入位点的外源铁蛋白基因(Pea－Fer)的秀水11(记为Fer34－XS11)，它与原轮回亲本秀水11(XS11，CK)组成一对近等基因系。

1.2 试验仪器

MM301玛瑙磨样机:德国Retsch(莱驰)公司;Agilent 7500a ICP－MS质谱仪:美国安捷伦公司;THU35C试验用砻谷机、TM05C试验用碾米机、旋风式磨粉机:佐竹机械(苏州)有限公司;NIRSystems 5000型近红外谷物分析仪(NIRSystems):福斯近红外系统公司;3－D型黏度速测仪(Rapid Visco Analyzer，RVA):澳大利亚 Newport Scientific仪器公司;TA.XT plus型质构分析仪:英国Stable Micro System公司;K575X/K575D喷金机:英国Emitech公司;SUPRATM超高分辨率场发射扫描电子显微镜:蔡司光学仪器(上海)国际贸易有限公司。

1.3 田间试验

田间试验于2009年夏季在浙江大学华家池校区实验农场(浙江杭州)进行，试验田为小粉土，肥力中等，pH 6.8，有机质36.2 g/kg，全氮2.1 g/kg，全磷0.4 g/kg，砂粒 16.5%，粉粒 50.2%，黏粒 33.2%。5月20日播种，6月20日移栽，单本插，插种规格25 cm×25 cm，两次重复，每小区种植180株，田间管理及栽培措施同当地大田生产。

1.4 PCR 检测

参试水稻叶片基因组DNA的提取采用CTAB的方法［14］;检测植株的外源铁蛋白基因(Pea－Fer)PCR法，与徐晓晖等［9］相同，正义引物P1:5'－ATCTTGCTGTTCCTTCTGTTCC－3'和反义引物 P2:5'－ATTGTTGCGTTCTGCCACAC －3'，可扩增出 Pea－Fer中的400 bp片段。

1.5 矿质元素检测

待测试样用MM301型玛瑙磨样机粉碎备用。在分析元素含量之前，样品在70℃下再烘干1次。所有样品先在电热板上200℃条件下完全碳化，后在550℃左右的马弗炉中灰化6 h，冷却后用5 mL体积比为1∶1优级纯盐酸溶解灰分，并用超纯水定量到50 g左右，最后用ICP－MS仪测定Fe、Mg、Ca、Mn、Zn 含量［15］。

1.6 外观与蒸煮食用品质鉴定

参试水稻在黄熟期进行收割、脱粒、晒干，室温下放置3个月后，其籽粒经THU35C试验用砻谷机脱壳后，用TM05C试验用碾米机自动碾磨，碾减率为10%左右，后取其中的一部分用旋风式磨粉机磨成粉末，过100目筛。按中华人民共和国农业部标准(NY147—1988)［16］进行测定米粒长、米粒宽、米粒长/宽比、垩白粒率、垩白度、透明度、糊化温度、胶稠度、直链淀粉含量等多项稻米外观与蒸煮食用品质性状。

1.7 蛋白质及其和氨基酸组成测定

蛋白质含量测定:每个样品称取精米粉0.5 g，按中国人民共和国国家标准GB 2905—1982分析，重复3次。

氨基酸含量测定:参照吴建国等［17］的方法，利用NIRSystems 5000型近红外谷物分析仪测定。各取精米粉3 g置于内径为35 mm石英窗的圆形样品盒中，在波长为1 100～2 498 nm的范围内，每隔2 nm采集一次反射强度(R)。每份样品重复扫描32次，贮存于计算机中，取平均值，并转化为1 g(1/R)。

1.8 淀粉黏滞性(RVA谱)测定

稻米淀粉黏滞性谱采用3－D型黏度速测仪(RVA)测定，用TCW(Thermal Cycle for Windows)配套软件进行分析。根据美国谷物化学协会(AACC)操作规程［18］，含水量为14.0%时，精米粉的样品量为3.0 g，加蒸馏水25.0 mL。50 ℃下保持1 min;以恒速升到95℃(3.8 min)，保持2.5 min;再以恒速下降到50℃(3.8 min)，保持12.5 min。搅拌器在起始10 s转动速度为960 r/min，之后保持在160 r/min。

在RVA谱特征值包含最高黏度(peak viscosity，PKV)、热浆黏度(hot paste viscosity，HPV)、冷胶黏度(cool paste viscosity，CPV)、崩解值(breakdown viscosity，BDV，最高黏度－热浆黏度)、消减值(setback vicosity，SBV，冷胶黏度－最高黏度)和回复值(consistence value，CSV，冷胶黏度－热浆黏度)等。黏滞性值单位用RVU(Rapid Visco Units)表示。

1.9 质地测定

利用TA.XT plus型质构分析仪测定质构特性。用RVA测定完的样品在4℃下放置12 h形成凝胶，并密封防止水分蒸发。用P/5探头测定，直径5 mm，测试速度2.0 mm/s，探入深度20 mm。根据用户指南软件 Texture Exponent 32(Version 4.0.8.0)，计算机自动得到以下表征米饭质地状况的评价参数:硬度、黏度、凝聚性以及黏附性［18］。

1.10 胚乳内淀粉粒电镜扫描分析

取参试材料进行胚乳内淀粉粒电镜扫描对比分析。观察时，参照张云康等［19］方法，即用小刀轻敲糙米近中部，尽量让其保持自然断裂，制成厚度约1 mm左右的样品，用导电胶粘附于样品台，置于喷金机上喷镀一层极薄的碳和金，然后用扫描电镜观察和摄影。工作时，加速电压200 kV，放大2 000倍拍照。

2 结果与分析

2.1 近等基因系外源铁蛋白基因(Pea－Fer)PCR检测

取Fer34－XS11和秀水11(CK)的叶片各12株，进行外源Pea－Fer基因PCR检测(图1)，结果显示，Fer34－XS11的外源Pea－Fer基因完全纯合，无任何分离现象。

图1 Fer34－XS11和秀水11(CK)植株叶片PCR检测

2.2 Pea－Fer对转基因稻米铁等5种重要矿质元素积累的影响

对Fer34－XS11和秀水11(CK)稻米进行了铁、镁、钙、锰、锌等5种重要矿质元素的含量检测(表1)。结果表明，Fer34－XS11稻米铁含量明显高于秀水11(CK)，增量达40.2%。经显著性检测，两者差异达显著水平。其余4种矿质元素(镁、钙、锰、锌)含量，Fer34－XS11与秀水11(CK)较为接近，两者差异不明显。可见外源铁蛋白基因(Pea－Fer)导入水稻，其功效可以提高稻米铁含量，但对镁、钙、锰、锌等矿质元素积累效应作用不甚明显。

表1 Fer34－XS11和秀水11(CK)稻米的5种重要矿质元素含量/μg/g

2.3 Pea－Fer对转基因稻米外观和蒸煮食用品质的影响

对Fer34－XS11和秀水11(CK)进行了稻米外观和蒸煮食用品质的检测(表2)。结果表明，从稻米外观上看，Fer34－XS11与秀水11(CK)的粒型相似，透明程度接近，两者的谷粒长、谷粒长宽比、垩白率、垩白度、透明度等5项指标均无显著差异。从蒸煮食用品质上看，Fer34－XS11与秀水11(CK)在检测的三项指标(碱消值、胶稠度、直链淀粉)方面也较为接近，经检测，两者间无显著差异。综上所述，Pea－Fer导入水稻，对稻米主要外观和蒸煮食用品质影响不大。就本试验而言，仍能保持原秀水11(CK)优质特性。2.4 Pea－Fer对转基因稻米蛋白质积累和氨基酸组成的影响

表2 Fer34－XS11和秀水11(CK)的稻米外观和蒸煮食用品质

对Fer34－XS11和秀水11(CK)的稻米用国标法进行蛋白质含量检测，并用近红外光谱分析仪对其氨基酸组成作了分析(表3)。结果表明，Fer34－XS11含蛋白质 12.3%，略高于秀水 11(CK)11.65%，但经显著性分析后，未达显著差异。受检测的17种氨基酸，除了Asp、Tyr、Arg有略微差异外，其余15种氨基酸两者均较为一致。可见Pea－Fer的导入，对稻米蛋白质积累和氨基酸组成的影响也非常有限。

表3 和秀水11(CK)的稻米蛋白质含量及其氨基酸组成/%

2.5 Pea－Fer对转基因稻米淀粉黏滞特性(RVA谱)的影响

对Fer34－XS11和秀水11(CK)进行稻米淀粉黏滞性RVA谱检测(图2)的结果表明，两者间RVA谱带非常接近，重合性好，在RVA谱6个参数性状(最高黏度、热浆黏度、冷胶黏度、崩解值、消减值、回复值)均无显著差异。这意味着Pea－Fer的导入，虽然对稻米铁元素的积累产生变化，但对稻米淀粉结构基本保持稳定不变。

图2 Fer34－XS11和秀水11(CK)的稻米RVA谱

2.6 Pea－Fer对转基因稻米质地的影响

对Fer34－XS11和秀水11(CK)用 TA.XT plus型质构分析仪进行米饭质地检测(图3)，结果表明，两者间质地特征曲线走向一致，叠加后发现，前期(0～2.99 s)Fer34－XS11峰值较秀水11(CK)稍低，表明其硬度略低于秀水11(CK);而中、后期(2.99～14.9 s)两者质地特征曲线重合性良好，表明黏度、凝聚性以及黏附性等特征参数相同。综合而言，Pea－Fer的导入，对米饭质地影响不大，从而也意味着淀粉结构保持较为稳定。

图4 Fer34－XS11和秀水11(CK)的稻米胚乳淀粉结构电镜扫描图(2 000倍)

2.7 Pea－Fer对转基因稻米胚乳淀粉结构影响的电镜观察

对Fer34－XS11和秀水11(CK)的籽粒淀粉颗粒进行扫描电镜观察(图4)。发现Fer34－XS11的淀粉颗粒形态与结构与秀水11(CK)相似。二者的淀粉颗粒都呈多面体，且棱角明显，同时，颗粒大小比较均匀。由此可见，Pea－Fer的导入并没有对稻米籽粒淀粉超结构造成显著影响。

3 讨论与结论

本研究对稻米外观和蒸煮食用品质、营养品质和淀粉结构等分析，并比较铁蛋白转基因稻米与非转基因亲本稻米的品质相关性状间异同，表明两者除籽粒铁含量性状外，米质组成和结构上均具有等同性。而有关稻米中铁含量的增高，正是所需目的基因引起的营养增值，这对富铁水稻的深入研究和应用有益。

具体而言，尽管Pea－Fer基因的导入和表达，使得Fer34－XS11水稻籽粒中Fe含量显著增加，但作为评价稻米品质的重要指标而言，Fer34－XS11稻米籽粒中垩白度、透明度、糊化温度(碱消值)、胶稠度、直链淀粉含量、淀粉RVA谱、米饭质地、淀粉粒微观结构，以及其他主要矿质元素、蛋白质含量和氨基酸组成等，与受体亲本秀水11相比，均未发生显著性变异。这说明Pea－Fer基因的导入和表达，在一定程度上提高了水稻植株体内铁蛋白的含量，并促使其通过调控亚铁氧化酶的活性而提升对铁的吸收，以无毒害的形式储存起来，在稻米籽粒营养积累时期流向籽粒，从而使得稻米籽粒中Fe含量显著性提高［20］，但对籽粒中储藏蛋白积累和氨基酸组成等营养品质，并没有不会显著改变;对籽粒胚乳淀粉积累程度、直链淀粉和支链淀粉的组成、淀粉粒团聚和排列结构等亦无明显影响。

试验检测显示Fer34－XS11稻米籽粒胶稠度大于60 mm，含直链淀粉16%，说明稻米柔软性好，蒸煮时吸水率低，米饭柔软，黏性较大，涨性小，冷却后仍能维持柔软的质地，食味品质较优;同时，Fer34－XS11与对照品种XS11的RVA图谱条带以及米饭质地条带非常接近，重合性很好，证明其依然保持原受体亲本秀水11良好的食味品质，适口性好［21－22］。经初步感官品尝，无论米饭光泽、香味、口感、食味、适口性、冷却后软硬程度等方面，Fer34－XS11与对照品种XS11均无明显差异，且优质可口。此外，还发现该外源基因导入水稻，对转基因受体水稻的农艺性状和经济性状也无显著影响［23－24］。这为利用该特异外源铁蛋白转基因水稻，生产富铁营养大米，解决人类铁缺引起的营养不良问题，提供了良好的应用前景。

［1］蒋家唤，郭奕明，杨映根，等.转基因水稻的研究和应用［J］.植物学通报，2003，20(6):736 －744

［2］聂以春，周肖荣，张献龙.转基因抗虫棉的产量、品质及抗虫性比较研究［J］.植物遗传资源科学，2002，3(4):8－12，35

［3］Leon E，Piston F，Aouni R，et al.Pasting properties of transgenic lines of a commercial bresd wheat expressing combinations of HMW glutenin subunit genes［J］.Journal of Cereal Science，2010，51(3):344 －349

［4］Wu D X，Shu Q Y，Wang Z H，et al.Quality variations in transgenic rice with a synthetic cry1AB gene from bacillus thuringiensis［J］.Plant Breeding，2002，121:198 －202

［5］Novak W K，Haslberger A G.Substantial equivalence of antinutrients and inherent plant toxins in genetically modified novel foods［J］.Food and Chemical Toxicology，2000，38:473 －483

［6］胡贻椿，陈天金，朴建华，等.转基因水稻及安全性的研究进展［J］.中国食物与营养，2009，8:19 －22

［7］叶红霞，郭泽建，舒庆尧，等.两份转Fer基因富铁水稻特异种质应用价值的初步评价［J］.中国水稻科学，2007，21(3):270－274

［8］叶红霞，郭泽健，李梅，等.豌豆铁蛋白转基因水稻纯系重要生物学特性变异研究［J］.农业生物技术学报，2007，15(2):251－256

［9］叶红霞，郭泽建，陈淑玲，等.豌豆铁蛋白转基因水稻纯系的稻米矿质元素及淀粉特性研究［J］.中国粮油学报，2007，22(5):1 －6

［10］崔海瑞，王忠华，舒庆尧，等.转Bt基因水稻克螟稻杂交转育后代农艺性状的研究［J］.中国水稻科学，2001，15(2):101－106

［11］Lynch P T，Jones J，Blackhall N W，et al.The phenotypic characterization of R2 generation transgenic rice plants under field and glasshouse conditions［J］.Euphytica，1995，85:395－401

［12］沈圣泉，舒庆尧，包劲松，等.应用近等基因系研究Bt基因对水稻性状表现的影响［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2005，31(3):283 －287

［13］徐晓晖，郭泽建，程志强，等.铁蛋白基因的水稻转化及其功能初步分析［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2003，29(1):49 －54

［14］Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］.Nucleic Acid Research，1980，8(19):4321－4325

［15］郝虎林，魏幼璋，杨肖娥，等.供氮水平对稻株铁、锰、铜、锌含量和稻米品质的影响［J］.中国水稻科学，2007，21(4):411－416

［16］NY147—1988米质测定方法［S］

［17］吴建国，石春海，张小明，等.用近红外反射光谱法分析稻米3种必需氨基酸含量的研究［J］.作物学报，2003，29(5):688－692

［18］AACC 61 ～01.01 －1995，Amylograph Method for Milled Rice［S］

［19］张云康，汤圣祥，李尧生，等.酿酒籼糯米胚乳淀粉粒的扫描电镜观察［J］.作物学报，1997，23(2):237－241

［20］Van W O，Briat J F.Conformational change and in vitro core－formation modifications induced by site－directed mutagenesisof the specific N － terminusof pea seed ferritin［J］.Biochemical Journal，1995，305(Pt3):959 －965

［21］谢新华，李晓方，肖昕.应用近红外透射光谱法测定稻米胶稠度研究［J］.中国粮油学报，2009，24(2):145－147

［22］迟明梅.大米食用品质的研究进展［J］.粮食加工，2005，1:48－51

［23］王淑珍，赵霏，任三娟，等.外源铁蛋白基因对水稻重要性状表达的影响［J］.核农学报，2010，24(4):694－697

［24］赵霏，任三娟，郭泽建，等.利用近等基因系研究豌豆铁蛋白基因对水稻重要生物学特性的影响［J］.农业生物技术学报，2011，19(1):63 －68.

Effect of Pea－Fer Gene on Quality Characters of Transgenic Rice

Zhao Fei1Ren Sanjuan1Guo Zejian2Wu Jianguo1Bao Jinsong1Shen Shengquan1
(College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University1，Hangzhou 310029)
(Department of Plant Pathology，China Agricultural University2，Beijing 100094)

A transgenic rice line of Fer34－XS11 containing Pea－Fer was backcrossed from donor parent(exogenous ferritin transgenic pure lines Fer34)and recurrent parent(Oryza sativa ssp.japanica)(Xiushui 11)successively with GUS detection method.The pure line and the former recipient parent(Xiushui 11)form a pair of isogenic lines，which were used to study the effect of Pea － Fer gene on main quality characters of the rice.It was found that the appearance of transgenic lines，chalkiness degree，transparency，gelatinization temperature，gel consistence and amylose content between the two kinds of rice are similar in the aspects of appearance，cooking and eating quality.Moreover，in the aspect of nutritional quality，the iron content of Fer34 － XS11 was significantly increased，but there was no significant differences in other mineral elements，protein and amino acid.Furthermore，the RVA profile，texture，the structure and pattern of the amyloplasts with scanning electron microscopic are the same as those of contrast.These results indicated that Pea － Fer gene in transgenic rice only improved the iron content，but could not cause the quality characters change compared with its original parent.

rice，transgenosis，Pea － Fer，cooking and eating quality，nutritive quality，RVA profile，texture，scanning electron microscopy

S511

A

1003－0174(2011)07－0001－06

浙江省科技攻关项目(2008C22075)，浙江省“8812”计划(2007C12020－1)，农业部行业专项“核技术农业应用”(200803034)

2010－09－15

赵霏，女，1986年出生，硕士，水稻转基因研究

沈圣泉，男，1962年出生，副教授，硕士生导师，水稻转基因及分子育种