人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响*

丁 浩， 李菊香， 洪 葵， 孙国芳， 张 南， 吴延庆， 吴清华， 程晓曙

(南昌大学第二附属医院心内科，江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006)

·论著·

人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响*

丁 浩， 李菊香△， 洪 葵， 孙国芳， 张 南， 吴延庆， 吴清华， 程晓曙

(南昌大学第二附属医院心内科，江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006)

目的探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs，然后给予1×105U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组：(1)空白对照组；(2)pEGFP-N2组；(3)pEGFP-N2/XPD组；(4)IL-6组；(5)IL-6 + pEGFP-N2组；(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况；用MTT法观察细胞增殖活力；用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果在荧光显微镜下，可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光，即转染成功；MTT结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(Plt;0.05)，并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(Plt;0.05)；流式细胞仪结果显示，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G0/G1期增加(Plt;0.05)、S期减少(Plt;0.05)、凋亡率增加(Plt;0.01)，并能抑制IL-6促进VSMCs G0/G1期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(Plt;0.01)；RT-PCR和Western blotting检测发现，重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(Plt;0.05或Plt;0.01)，同时Bcl-2表达降低，Bax和wt-P53表达增高(Plt;0.05或Plt;0.01)，并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(Plt;0.05或Plt;0.01)。结论XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡，并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用，有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。

着色性干皮病D组基因； 白细胞介素-6； 血管平滑肌细胞； 细胞增殖； 细胞凋亡

人着色性干皮病D组(xeroderma pigmentosum group D,XPD)蛋白是转录因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的一个组份[1]。大量研究发现,XPD除了在TFⅡH介导的核苷酸切除修复和转录过程中发挥主要作用外,还参与了细胞的增殖、凋亡、肿瘤的发生甚至化疗药物抗药性的产生等多种生理及病理机制[2,3]。有研究表明，XPD基因能抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡[4]。

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病的重要病理基础，有着较高的致病率和致死率，是一类严重威胁人类健康的疾病。目前对AS发病原因尚未完全确定,可能与年龄、性别、血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病、肥胖、感染等因素有关[5,6]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)过度增殖被认为是促进AS发生发展的一个关键因素[7]。而且，在AS损伤中，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)起到了刺激VSMCs过度增殖的作用[8]。为此，本研究将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染VSMCs使得XPD高表达，并给予IL-6处理，然后观察VSMCs增殖和凋亡的变化，以探讨XPD对IL-6促进VSMCs增殖作用的影响。

材 料 和 方 法

1材料

人脐动脉平滑肌细胞株(human umbilical artery smooth muscle cells，HUASMCs)购自中国医学科学院细胞中心；培养基DMEM和胎牛血清购自Hyclone；重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2由南昌大学第二附属医院消化疾病研究所张吉翔教授惠赠，pEGFP-N2/XPD已通过PCR反应、酶切及基因测序三重鉴定；脂质体LipofectamineTM2000和TrizolTM购自Invitrogen；IL-6购自Peprotech；MTT购自上海普飞生物技术有限公司；DMSO购自Amresco；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技公司；逆转录试剂盒购自Promega；引物由Generay Biotech合成；2×Taq PCR MasterMix购自天根生物技术有限公司；Ⅰ抗XPD、Bcl-2、Bax、wt-P53和β-actin抗体购自Santa Cruz；Ⅱ抗辣根过氧化物酶IgG购自北京中杉金桥公司。

2方法

2.1细胞培养、质粒的转染和IL-6的处理 将VSMCs置于含10%胎牛血清和双抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)的DMEM培养基的培养瓶中，37 ℃、饱和空气湿度和5%CO2孵箱内培养。以2×105cells/well的密度将细胞铺于6孔板内，24 h后细胞融合率约为90%，质粒每孔4.0 μg，脂质体每孔10 μL介导转染。转染6 h后换有血清的培养基培养。转染48 h后用含800 mg/L G418的选择培养基培养，经有限稀释法筛选4周获得2株稳定表达的细胞株，即稳定转染重组质粒pEGFP-N2/XPD和稳定转染pEGFP-N2的VSMCs。实验时给予终浓度为1×105U/L IL-6孵育48 h[9]。根据处理因素的不同，实验分为6组：(1)空白对照组；(2)pEGFP-N2组；(3)pEGFP-N2/XPD组；(4)IL-6组；(5)IL-6 + pEGFP-N2组；(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。孵育结束后收获细胞。在荧光显微镜下观察，荧光显微镜激发光波长395 nm，观察pEGFP释放波长为508 nm的绿色荧光。

2.2MTT检测细胞增殖活力 将细胞种植在96孔板中，每孔1×103个细胞，空白调零孔只加不含细胞的培养基。实验处理后，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，继续培养4 h，弃上清，加入100 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪(Labststems)测定492 nm处各孔吸光度(A)值。计算细胞存活率，细胞存活率=(A实验组/A对照组)×100%。

2.3流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率 用胰酶消化收集上述各组细胞，应用FACSCalibar流式细胞仪(Beckton Dickinson)分析细胞周期，得出各细胞周期的百分率。流式细胞仪检测细胞凋亡率按试剂说明书进行，主要步骤为：用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，再用500 μL Binding Buffer悬浮细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，最后用流式细胞仪检测。

2.4RT-PCR检测mRNA表达水平 细胞总RNA抽提和逆转录参照试剂说明书进行操作。XPD正义链引物5’-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3’，反义链引物5’-CGATTCCCTCGGACACTTT-3’，产物为363 bp。Bcl-2正义链引物5’-GGTGCCACCTGTGGTCCA-3’，反义链引物5’-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3’，产物为451 bp。bax正义链引物5’-GGATGCGTCCACCAAGAA-3’，反义链引物5’-GCACTCCCGCCACAAAGA-3’，产物为386 bp。野生型p53(wild type P53, wt-P53)正义链引物5’-CTACAAGCAGTCACAGCACATGAC-3’，反义链引物5’-TCATTCAGCTCTCGGAACATCTCG-3’, 产物为551bp。β-actin正义链引物5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，反义链引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，产物大小为285 bp。PCR反应体系如下:cDNA 500 ng，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,补去离子水至终体积25 μL。按下列条件进行扩增：预变性，1个循环，94 ℃ 5 min；PCR反应，35个循环，94 ℃ 40 s，退火 40 s,72 ℃ 55 s；延伸，72 ℃ 7 min。退火温度：XPD 53 ℃，Bcl-2 58 ℃，Bax 54 ℃，wt-P53 57 ℃,β-actin 55 ℃。取5 μL PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用UV暗箱式紫外透射仪观察电泳结果并拍照。结果用Band Leader软件，以目的条带/β-actin的灰度值进行分析。

2.5Western blotting检测蛋白表达水平 用RIPA法取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取20 μg进行SDS-PAGE电泳分离蛋白。蛋白转印到硝酸纤维素膜上,3%的BSA液4 ℃封闭过夜。膜分别用XPD、Bcl-2、Bax、wt-P53和β-actin的Ⅰ抗 (1∶200稀释) 孵育,4 ℃过夜, Ⅱ抗孵育2 h,DAB显色照相。结果用UVP LabWork 3.0 软件, 以目的条带/β-actin的灰度值进行分析。

3统计学处理

结 果

1质粒转染成功的鉴定

pEGFP-N2载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白报告基因。因此，将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2转染入VSMCs后，在荧光显微镜下可观察到细胞中绿色荧光蛋白的表达，而未转染质粒的细胞则未见绿色荧光，见图1。这表明质粒均转染成功。

Figure 1. The result of fluorescence microscope after plasmid transfection(×100). A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6+pEGFP-N2/XPD group.

2pEGFP-N2/XPD转染和IL-6对VSMCs增殖活力的影响

MTT结果显示，设定空白对照组的存活率为100%，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的细胞存活率明显低于空载质粒pEGFP-N2组(Plt;0.05)；IL-6处理组的细胞存活率明显高于空白对照组(Plt;0.05)；IL-6 + pEGFP-N2/XPD组的细胞存活率明显低于IL-6 + pEGFP-N2组(Plt;0.05)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间、IL-6处理组与IL-6 + pEGFP-N2组之间相比，差异无显著(均Pgt;0.05)。这说明pEGFP-N2/XPD的转染能抑制VSMCs的增殖活力，IL-6能促进VSMCs增殖，而pEGFP-N2/XPD的转染能抑制IL-6这一作用，见表1。

表1 pEGFP-N2/XPD转染和IL-6处理后VSMCs存活率、细胞周期及凋亡率的变化

3pEGFP-N2/XPD转染和IL-6对VSMCs细胞周期的影响

流式细胞术结果显示，与空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的G0/G1期细胞明显增多(Plt;0.05)，S期细胞明显减少(Plt;0.05)；与空白对照组相比，IL-6处理组的G0/G1期细胞明显减少(Plt;0.05)，S期细胞明显增多(Plt;0.01)；与IL-6 + pEGFP-N2组相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD组的G0/G1期细胞明显增多(Plt;0.01)，S期细胞明显减少(Plt;0.01)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间、IL-6处理组与IL-6 + pEGFP-N2组之间相比，差异无显著(均Pgt;0.05)。这说明pEGFP-N2/XPD的转染能使得VSMCs进入S期出现障碍，停滞在G0/G1期的细胞增多，IL-6能使得VSMCs进入S期细胞增多，停滞在G0/G1期的细胞减少，而pEGFP-N2/XPD的转染能抑制IL-6这一作用，见表1。

4pEGFP-N2/XPD转染和IL-6对VSMCs凋亡率的影响

流式细胞术结果显示，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的细胞凋亡率明显高于空载质粒pEGFP-N2组(Plt;0.01)；IL-6处理组的细胞凋亡率明显低于空白对照组(Plt;0.01)；IL-6 + pEGFP-N2/XPD组的细胞凋亡率明显高于IL-6 + pEGFP-N2组(Plt;0.01)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间、IL-6处理组与IL-6 + pEGFP-N2组之间相比，差异无显著(均Pgt;0.05)。这说明pEGFP-N2/XPD的转染能促进VSMCs的凋亡，IL-6能减弱VSMCs的凋亡，而pEGFP-N2/XPD的转染能抑制IL-6这一作用，见表1。

5pEGFP-N2/XPD转染和IL-6对VSMCs的XPD、bcl-2、bax和wt-p53mRNA表达水平的影响

RT-PCR结果显示，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD mRNA的表达(Plt;0.01)；与空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的bax和wt-p53 mRNA的表达明显增多(Plt;0.05)，bcl-2 mRNA的表达明显减少(Plt;0.01)；与空白对照组相比，IL-6处理组的bax和wt-p53 mRNA的表达明显减少(Plt;0.01)，Bcl-2 mRNA的表达明显增多(Plt;0.05)；与IL-6 + pEGFP-N2组相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD组的Bax和wt-p53 mRNA的表达明显增多(Plt;0.01)，bcl-2 mRNA的表达明显减少(Plt;0.05)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间、IL-6处理组与IL-6 + pEGFP-N2组之间相比，差异无显著(均Pgt;0.05)。这说明pEGFP-N2/XPD的转染能增加VSMCs的XPD mRNA的表达，同时使得Bcl-2 mRNA的表达降低、bax和wt-p53 mRNA的表达增高，IL-6能使得bcl-2 mRNA的表达增高、bax和wt-p53 mRNA的表达降低，而pEGFP-N2/XPD的转染能抑制IL-6这一作用，见图2。

6pEGFP-N2/XPD转染和IL-6对VSMCs的XPD、Bcl-2、Bax和wt-P53蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示，pEGFP-N2/XPD的转染明显增加了XPD 蛋白的表达(Plt;0.05)；与空载质粒pEGFP-N2组相比，转染重组质粒pEGFP-N2/XPD组的Bax和wt-P53蛋白的表达明显增多(Plt;0.05)，Bcl-2蛋白的表达明显减少(Plt;0.05)；与空白对照组相比，IL-6处理组的Bax(Plt;0.05)和wt-P53(Plt;0.01)蛋白的表达明显减少，Bcl-2蛋白的表达明显增多(Plt;0.05)；与IL-6 + pEGFP-N2组相比，IL-6 + pEGFP-N2/XPD组的Bax和wt-P53蛋白的表达明显增多(Plt;0.01)，Bcl-2蛋白的表达明显减少(Plt;0.05)；而空白对照组与转染空载质粒pEGFP-N2组之间、IL-6处理组与IL-6 + pEGFP-N2组之间相比，差异无显著(均Pgt;0.05)。这说明pEGFP-N2/XPD的转染能增加VSMCs的XPD蛋白的表达，同时使得Bcl-2蛋白的表达降低、Bax和wt-P53蛋白的表达增高，IL-6能使得Bcl-2蛋白的表达增高、Bax和wt-P53蛋白的表达降低，而pEGFP-N2/XPD的转染能抑制IL-6这一作用，见图3。

Figure 2. The changes of XPD, bcl-2, bax and wt-P53 mRNA level in VSMCs treated with pEGFP-N2/XPD transfection and IL-6. M: marker.A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6 + pEGFP-N2/XPD group±s. n=3. *Plt;0.05, ** Plt;0.01 vs B group；#Plt;0.05, ## Plt;0.01 vs A group；▲Plt;0.05, ▲▲ Plt;0.01 vs E group.

Figure 3. The changes of XPD, Bcl-2, Bax and wt-P53 protein levels in VSMCs treated with pEGFP-N2/XPD transfection and IL-6. A:blank control group；B:pEGFP-N2 group；C:pEGFP-N2/XPD group；D:IL-6 group；E:IL-6 + pEGFP-N2 group；F:IL-6 + pEGFP-N2/XPD group. ±s. n=3. *Plt;0.05 vs B group；#Plt;0.05, ## Plt;0.01 vs A group；▲Plt;0.05, ▲▲ Plt;0.01 vs E group.

讨 论

TFⅡH是一个由9个亚基(XPB、XPD、P62、P52、P44、P34、cdk7、cyclinHT和MATl)组成的多酶复合物，XPD作为支架，介导着复合物内部的连接[10]。XPD基因的突变与3种人类遗传性疾病相关，分别是着色性干皮病，Cockayne综合征和毛发硫性营养不良[11]。XPD具有单链DNA解旋酶活性[12]，参与了核酸剪切修复，它的功能缺陷可导致突变的基因不能得到有效的修复，同时也会影响一些癌基因和抑癌基因的功能，从而促使肿瘤的发生[13]。而且，已经有研究发现，XPD能抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡[4]。

近年来的观点认为AS是一种炎症性疾病[14，15]。其中，VSMCs过度增殖被认为是促进AS发生发展的一个关键因素[7]。而且，在AS损伤中，IL-6[8]、干扰素-γ[16]和低密度脂蛋白[17]等因素能刺激VSMCs过度增殖。由此可见，与肿瘤的发生类似，AS亦是由细胞的异常增殖而引起的。

因此，我们可以假设：XPD能抑制IL-6介导的VSMCs过度增殖，并促进其凋亡。为此，本研究将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染VSMCs使得XPD高表达，并给予IL-6刺激VSMCs增殖，然后观察VSMCs增殖和凋亡的变化。结果显示，XPD高表达能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡，能增加Bax和wt-P53的表达，降低Bcl-2的表达；IL-6能刺激VSMCs增殖并抑制其凋亡，能降低Bax和wt-P53的表达，增加Bcl-2的表达；而XPD高表达能抑制IL-6的这一作用。

在AS的发病机制中，IL-6刺激VSMCs过度增殖[8]。本研究用IL-6刺激VSMCs增殖，这在一定程度上类似于AS的发生。而XPD高表达能抑制IL-6促增殖及抑凋亡的作用，这提示我们也许可以通过上调VSMCs的XPD表达来治疗AS。bcl-2基因是抑凋亡基因，bax基因是促凋亡基因，Bcl-2蛋白表达升高和Bax蛋白表达降低被认为是凋亡被抑制。在本研究中，XPD能抑制IL-6升高VSMCs的Bcl-2表达和降低Bax表达的作用，即进一步证明XPD能减弱IL-6抑制VSMCs凋亡的作用。P53有野生型和突变型两种亚型，其中野生型P53(wt-P53)对细胞凋亡有促进作用。在本研究中，XPD能升高wt-P53的表达，即XPD促凋亡作用是通过P53这条途径来实现的，这与同为TFⅡH亚基的XPB通过P53凋亡途径产生促凋亡作用一致[18]。综上所述，XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡，并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用，有望成为治疗AS的靶点。

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EffectsofhumanxerodermapigmentosumgroupDgeneonproliferationofhumanvascularsmoothmusclecellsinducedbyinterleukin-6

DING Hao, LI Ju-xiang, HONG Kui, SUN Guo-fang, ZHANG Nan, WU Yan-qing, WU Qing-hua, CHENG Xiao-shu

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,Nanchang330006,China.E-mail: 24055886@qq.com)

AIM: To investigate the effects of human xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene on the proliferation of human vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by interleukin-6 (IL-6).METHODSRecombinant plasmid pEGFP-N2/XPD and vacant plasmid pEGFP-N2 were transfected into VSMCs by liposome, and then these cells were incubated with IL-6 at 1×105U/L for 48 h. The cells were divided into 6 groups: blank control group; pEGFP-N2 group; pEGFP-N2/XPD group; IL-6 group; IL-6 + pEGFP-N2 group; IL-6 + pEGFP-N2/XPD group. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope. The cell growth was detected by MTT method. The cell cycle and apoptosis rate were examined by flow cytometre. The expression levels of XPD, Bcl-2, Bax and wild type P53 (wt-P53) were detected by RT-PCR and Western blotting.RESULTSGreen fluorescence was observed in the cells transfected with pEGFP-N2/XPD or pEGFP-N2, indicating successful transfection MTT results showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD inhibited the cell growth, and reduced the positive effects of IL-6 on VSMCs growth. Flow cytometry results showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD increased the apoptosis rate of VSMCs and the cell numbers in G0/G1phase, decreased the cell numbers in S phase, and reduced the effects that IL-6 decreased the apoptosis rate of VSMCs and the cell numbers in G0/G1phase, and increased the cell numbers in S phase. The results of RT-PCR and Western blotting showed that the transfection of pEGFP-N2/XPD increased the expression of XPD, Bax and wt-P53, decreased the expression of Bcl-2, and reduced the effects that IL-6 decreased the expression of Bax and wt-P53, and increased the expression of Bcl-2.CONCLUSIONXPD gene inhibits VSMCs proliferation, promotes VSMCs apoptosis, and reduces the effects that IL-6 promotes VSMCs proliferation and inhibits VSMCs apoptosis. Therefore, XPD gene is likely to be potential molecular target for treatment of atherosclerosis.

Xeroderm pigmentosum group D gene; Interleukin-6; Vascular smooth muscle cells; Cell proliferation; Apoptosis

1000-4718(2011)04-0625-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.001

2010-11-08

2011-02-25

国家重点基础研究发展计划(“973”计划)资助项目(No.2008CB517305)

△通讯作者 Tel：0791-8060095；E-mail:24055886@qq.com