苎麻脱胶高效菌剂活化技术研究

冯湘沅 刘正初 段盛文 郑科 成莉凤 郑霞

摘要：ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂在４～８℃冷藏柜中保存540 d，分段取样进行成活率检测，开展高效菌剂活化技术研究。结果表明，ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，其成活率保持在８０％以上；该菌剂活化技术具有工艺流程短、技术难度小等特点，采用常规培养基对高效菌剂进行苏醒与扩增（６、８ ｈ）、诱导（５ ｈ）两个步骤，即可获得６ ｈ完成苎麻脱胶的活化菌液；确保高效菌剂活化成功的关键在于掌握“休眠态的高效菌剂在苏醒与扩增过程的适应期长短与保存期呈正相关”的技术原理。其结果可为降低企业实施苎麻生物脱胶工艺的技术风险、长期保持高效菌剂的优良性能提供科学依据。

关键词：苎麻脱胶；高效菌剂；活化技术

中图分类号：Ｓ５６３．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3136-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｒａｍｉｅ Ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ

ＦＥＮＧ Ｘｉａｎｇ－ｙｕａｎ，ＬＩＵ Ｚｈｅｎｇ－ｃｈｕ，ＤＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｗｅｎ，ＺＨＥＮＧ Ｋｅ，ＣＨＥＮＧ Ｌｉ－ｆｅｎｇ，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＸＪＺＵ－１２０ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ４～８ ℃ ｉｎ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒ ｗｉｔｈｉｎ 540 d ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ by step dyeing． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｖｅｒ ８０％ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ 540 d， ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ａｆｔｅｒ ａｗａｋｅｎｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６、８ ｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ５ ｈ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｒａｍｉｅ ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ６ ｈ； ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ｏｐｅｒａｂｌｅ， ａｎｄ ｓｏ ｏｎ； ｔｈｅ ｋｅｙ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｉｓｋ ａｎｄ ｋｅｅｐｉｎｇ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒａｍｉｅ ｂｉｏ－ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ； ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

随着当今世界能源的紧缺以及国家对环保力度的加强，草本纤维资源的开发已引起了人们的高度重视。鉴于草本纤维的提取沿用普遍的传统和化学方法造成对环境的污染等问题［１－２］，中国农业科学院麻类研究所工程酶项目组针对草本纤维原料的特性，对从自然界分离并采用基因工程手段选育的一个高效菌株进行了系列研究［３－５］，研究形成了“苎麻生物脱胶工艺技术与设备（ＺＬ９５１１２５６４．８）［６］”、“欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺（ＺＬ ０７ １ ０３０５３４０．５）［７］”以及“一种草本纤维工厂化脱胶或制浆用高效菌剂制备方法（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）［８］”等发明专利。同时，应用这些专利技术在湖南沅江市明星麻业有限公司、湖北精华纺织集团有限公司等单位建成了高效节能清洁型苎麻生物脱胶示范工程。

本研究在前期研究基础上，专门生产了一批高效菌剂在适宜温度下进行了长期保存，拟通过定期取样进行活化与鉴定，以期获得高效菌剂活化技术，为降低企业实施苎麻生物脱胶工艺的技术风险、长期保持高效菌剂的优良性能提供科学依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１高效菌剂ＣＸＪＺＵ－１２０菌株２００５年，通过紫外线诱变欧文氏杆菌ＣＸＪＺ９５－１９８而获得变异菌株，２００７年４月以来在高效节能清洁型苎麻生物脱胶示范工程推广应用的菌种。制备方法详见发明专利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）说明书。高效菌剂采用可灭菌离心管分装，塑料真空袋外包装，４～８℃冷藏柜保存１８个月。

１．１．２活化培养基①苏醒与扩增培养基。主要组分为葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏、ＮａＣｌ、保护剂，自来水配制，自然ｐＨ值，灭菌后备用；②诱导培养基。主要组分为豆饼粉、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、诱导剂，自来水配制，自然ｐＨ值，灭菌后备用。

１．２方法

１．２．１高效菌剂活化前检测保存期分别为１、３、５、７、３０、９０、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０ ｄ，取出高效菌剂用显微镜进行观测，主要检测菌体草酸铵结晶紫染色深浅程度，每个样品取５个视野数出深色菌体（活菌）、浅色菌体（躯壳或死菌）的数量，加权平均可计算出活菌所占比例；比较并记录菌体形态是否有变化。同时，采用平板计数法测定不同保存期样品的活菌量，与分装前高效菌剂活菌量进行比较并计算出活菌所占比例。

１．２．２高效菌剂活化①苏醒与扩增。按照苏醒与扩增培养基２％的比例添加不同保存期的高效菌剂，３５ ℃，１８０ ｒ/min振荡１０ ｈ；②诱导。按照诱导培养基２％的比例接种苏醒与扩增菌液，３５ ℃，１８０ ｒ/min振荡５ ｈ。

１．２．３高效菌剂活化效果检测①苏醒与扩增过程。采用７５５Ｂ型紫外／可见分光光度计检测ＯＤ６００nm变化情况［９］；②诱导培养液（活化菌液）用于苎麻生物脱胶试验。浴比为１∶１０，菌液稀释５０倍，用自来水配制接种菌液，分装到５００ ｍＬ锥形瓶中（３００～３５０ ｍＬ／瓶），预热至３５ ℃，将３０～３５ ｇ苎麻置于接种菌液中浸泡１５ ｍｉｎ，倒出接种余液，置于３５ ℃恒温恒湿培养箱中发酵６ ｈ。按照本课题组创立的“麻管实效法”记录脱胶结果。

２结果与分析

２．１高效菌剂保存过程的监测结果

２．１．１保存过程活菌数量变化情况根据试验设计方案，定期取出不同保存期的高效菌剂进行观测，结果列于表１。由表１可见，两种方法检测不同保存期的高效菌剂成活率变化趋势基本相同，数值比较接近。平板计数数值偏低，原因可能是极少数染色深的菌体实际成活能力不强；高效菌剂在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d，依然有８０％以上的成活率；成活率下降比较快的时段在５～３０ ｄ，保存90 d以后的成活率下降幅度比较缓慢。

２．１．２保存过程菌体形态变化情况图１为高效菌剂保存３０ ｄ稀释１００倍样品的随机视野显微照片。照片中有９０％以上、染色较深的长杆状菌体，通过平板计数，证明它们就是可以活化出来的正常菌体；同时，也有少数形态不很规则而且染色较浅的菌体，可能就是实际成活能力不强的菌体或者死亡的菌体躯壳。

２．２高效菌剂活化效果监测结果

２．２．１高效菌剂苏醒与扩增过程ＯＤ值检测结果如图２所示。由图２ 可知，保存期在540 d以内的高效菌剂，经过８～１０ ｈ苏醒与扩增，均可形成ＯＤ600nm超过１．５的活化态菌液；保存期在７ ｄ以内的高效菌剂，其适应期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 d以内，其适应期在４ ｈ左右，保存期超过90 d，其适应期长达５ ｈ。概括起来说，处于休眠态的高效菌剂在苏醒与扩增过程的适应期长短与保存期呈正相关。可以说，这就是高效菌剂活化工艺的技术原理。只要掌握了这个原理，就能根据高效菌剂保存期的长短适当调节苏醒与扩增的时间，就可以获得理想的高效菌剂活化效果。

２．２．２活化菌液用于苎麻生物脱胶试验将６、８ ｈ苏醒与扩增菌液进行诱导培养５ ｈ以后，接种到苎麻上进行湿润发酵６ ｈ，观测脱胶效果见表２。表２结果表明，保存期在540 d以内的高效菌剂，经过８ ｈ苏醒与扩增所获得的菌液诱导培养５ ｈ以后，接种到苎麻上进行湿润发酵６ ｈ，即可完成苎麻脱胶；保存期在３０ ｄ以内的高效菌剂，经过６ ｈ苏醒与扩增所获得的菌液诱导培养５ ｈ以后，接种到苎麻上进行湿润发酵６ ｈ，即可完成苎麻脱胶。

３结论

１）在４～８ ℃下保存540 d的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂还有较高成活率。结果表明，按照发明专利（ＺＬ ０２ １ ０８８２０．９）说明书生产的ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂，在４～８ ℃冷藏柜中保存540 d以后，成活率还有８０％以上，经过８ ｈ苏醒与扩增所获得的菌液诱导培养５ ｈ，接种到苎麻上进行湿润发酵６ ｈ，即可完成苎麻脱胶。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂活化技术具有工艺流程短、技术难度小等特点。无论是苏醒与扩增培养基还是诱导培养基的主要组分都属于常规物质。不同保存期的高效菌剂只需要经过６～８ ｈ苏醒与扩增和５ ｈ诱导培养这两个简单的工艺过程（累计１１～１３ ｈ），均可形成用于苎麻脱胶的活化菌液，接种到苎麻上湿润发酵６ ｈ就能完成苎麻脱胶。

３）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂活化的关键在于掌握菌剂活化技术原理。处于休眠态的高效菌剂在苏醒与扩增过程的适应期长短与保存期呈正相关，这就是高效菌剂活化的技术原理。结果显示，保存期在７ ｄ以内的高效菌剂，其适应期在３ ｈ左右，保存期在７ ｄ以上90 ｄ以内，其适应期在４ ｈ左右，保存期超过90 ｄ，其适应期长达５ ｈ。结果还显示，保存90 ｄ以上的高效菌剂经过６ ｈ苏醒与扩增所获得的菌液诱导培养５ ｈ，接种到苎麻上进行湿润发酵６ ｈ，不能完成苎麻脱胶。

４讨论

１）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂保质期的界定。本试验仅以高效菌剂成活率、活化菌液用于苎麻脱胶的效果等指标对不同保存期的高效菌剂进行了活化技术研究，没有严格按照保质期的指标要求设计试验方案，可能是一个缺陷。苎麻是一种原产于中国、盛产于中国的特色农产品［１０］，通过脱胶（初加工）获得的产品仅用作纺织工业等制造业的基础材料，附加值不会很高，在目前的科学技术和生产力水平下，采用高效菌剂进行苎麻脱胶应该说是合适的选择，也是最近取得的突破性成果，但是目前国内外没有相关标准可以借鉴。

２）ＣＸＪＺＵ－１２０高效菌剂成活率下降速率不一致的原因。根据生物活体休眠保存理论，高效菌剂成活率下降速率应该与保存时间呈线性关系。但是，试验结果显示，高效菌剂在４～８ ℃冷藏柜中保存540 ｄ，依然有８０％以上的成活率，成活率下降比较快的时段在５～３０ ｄ，保存90 ｄ以后的成活率下降幅度比较缓慢。其原因有待进一步研究。

参考文献：

［１］ 刘正初．用科学发展观看我国草本纤维产业前景［Ｊ］．中国麻业科学，２００７，２９（B2）：６８－７１．

［２］ 刘正初．麻类纤维提取工程微生物研究回顾与展望［Ｊ］．中国农业科学，２００７，４０（Z1）：３６３－３６７．

［３］ 刘正初，彭源德，冯湘沅，等．苎麻生物脱胶新技术工业化生产应用研究［Ｊ］．纺织学报，２００１，２２（２）：27－29．

［４］ 刘正初，张运雄，冯湘沅，等．清洁型草本纤维生物提取工艺的污染机理研究［Ｊ］．中国农业科学，２００８，４１（２）：５４６－５５１．

［５］ 顾佳佳，刘正初，张运雄，等．ＣＸＪＺ９５－１９８菌株果胶酶活力检测的方法研究［Ｊ］．中国麻业科学，２００６，２８（６）：３０９－３１２．

［６］ 刘正初，彭源德，冯湘沅，等．苎麻生物脱胶工艺技术与设备［Ｐ］．中国专利：ＺＬ ９５１１２５６４．８，１９９６－０９－０４．

［７］ 刘正初，彭源德，冯湘沅，等．欧文氏杆菌工厂化发酵快速提取苎麻纤维工艺［Ｐ］．中国专利：ＺＬ ０７１０３０５３４０．５，２００８－０８－０６．

［８］ 刘正初，彭源德，冯湘沅，等．一种草本纤维工厂化脱胶或制浆用高效菌剂制备方法［Ｐ］．中国专利：ＺＬ ０２１０８８２０．９，２００３－１０－２２．

［９］ 李学贵，袁生．微生物转化过程中利用ＯＤ值实时监测细菌生物量变化的研究［Ｊ］．南京师大学报（自然科学版），２００３，２６（４）：９０－９３．

［１０］ 刘正初．我国苎麻产业发展的前景与对策［Ｊ］．中国麻作，１９９５， １７（１）：４５－４６．