HPLC 测定芝麻油中木脂素类化合物含量研究

黄纪念 宋国辉 孙 强 詹传保

(河南省农科院农副产品加工研究所,郑州 450002)

HPLC 测定芝麻油中木脂素类化合物含量研究

黄纪念 宋国辉 孙 强 詹传保

(河南省农科院农副产品加工研究所,郑州 450002)

建立了 HPLC同时测定芝麻油中芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚 4种木脂素化合物含量的方法。首先确定了 HPLC法分离和测定这 4种物质的色谱条件,色谱柱为 ODS-C18(250 mm ×4.6 mm,5μm);检测波长:芝麻素和芝麻林素为 287 nm,芝麻酚和芝麻素酚为 293 nm;柱温 30℃;流速 0.8 mL/min,流动相为甲醇 (A)和水 (B)进行梯度洗脱,梯度为 0 min(A,60%)→6 min(A,60%)→9 min(A,75%)→24 min(A,70%)→27 min(A,60%)→32 min(A,60%)。同时比较筛选了皂化法、氧化铝柱层析法和薄层层析法 3种去除脂肪类成分的前处理方法,确定薄层层析法为最有效的前处理方法。

芝麻素 芝麻林素 芝麻酚 芝麻素酚 高效液相色谱法

芝麻中含有芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚等木脂素类化合物,这些物质的存在大大提高了芝麻油的稳定性,同时也是芝麻油具有众多生物功能活性的物质基础。其中芝麻素和芝麻林素含量相对较高,芝麻素在在芝麻油中含量为 0.4%～0.8%,芝麻林素在在芝麻油中为 0.2%～0.4%[1]。芝麻种子中一般不含有芝麻酚和芝麻素酚,我国的特色产品“香油”属于焙炒芝麻油,在焙炒过程中产生芝麻酚和芝麻素酚。它们在焙炒芝麻油中含量很低,不超过 0.01%[2],但其抗氧化活性却远远高于芝麻素和芝麻林素,是焙炒芝麻油的稳定性远远高于非焙炒芝麻粗油的原因所在 (非焙炒芝麻粗油几乎不含有芝麻酚和芝麻素酚)。

对芝麻及芝麻油中木脂素类化合物含量的检测方法主要有分光光度法、薄层色谱法 (TLC)和 HPLC法等[3]。分光光度法干扰大,准确性低,一般用于木脂素总量的测定[4]。薄层色谱法一般用于木酯素类的分离和鉴定,用于定量分析则准确度较低[5]。HPLC法是定量分析芝麻木脂素类化合物的主要方法[6-10],测定结果最为准确。国内对芝麻及芝麻油中抗氧化物质的HPLC法测定主要局限于芝麻素和芝麻林素[6-7],芝麻酚和芝麻素酚由于含量低,特别芝麻素酚缺乏标准对照品,能同时测定芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚这 4种物质的还未见报道。国外对芝麻油中抗氧化物质的 HPLC法测定是采用溶剂溶解油样直接测定,未经过前处理去除脂肪类成分[8-10]。大量的脂肪类成分的存在影响分离的效果,会造成基线漂移厉害,峰形不好,杂峰多及干扰严重,影响测定的准确性。而且脂肪类成分与反相色谱填料结合牢固,不易洗脱,会造成柱压升高,柱效变差,色谱柱损耗严重。

因此,建立合理有效的能同时测定芝麻油中这 4种物质的检测方法,对芝麻中木脂素类物质的深入研究及开发应用具有重要意义。本研究首先确定了能同时分离芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚 4种成分的仪器色谱条件,然后对比筛选了皂化法、氧化铝柱层析法和薄层层析法这 3种前处理去除油脂的方法,确定了去除脂肪类物质效果最好的前处理方法,从而建立完整的 HPLC测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ulti mate3000高效液相色谱仪:美国戴安公司;XBPODS-C18色谱柱 (25 mm ×4.6 mm,5μm);XBPC18保护柱;PDA-3000二极管阵列检测器。

芝麻素标准品 (纯度 98%):中国药品生物制品检定所;芝麻酚标准品 (纯度 98%):Alfa Aesar公司;芝麻林素及芝麻素酚标准品,试验室自制,I R,MS,NMR对其进行了确证,HPLC检测纯度分别为97.08%和97.46%;芝麻油:市售小磨香油 (产自郑州);甲醇:色谱纯,美国迪马公司;超纯水由艾柯超纯水机制。

1.2 色谱条件

色谱柱:XBPODS-C18色谱柱 (25 mm ×4.6 mm,5μm);检测波长:芝麻素和芝麻林素为 287 nm,芝麻酚和芝麻素酚为 293 nm;柱温:30℃;流速:0.8 mL/min;洗脱剂及洗脱梯度见表 1。

表 1 HPLC洗脱梯度

1.3 标准溶液的配制

称取 5 mg芝麻酚、5 mg芝麻素酚、10 mg芝麻素和 6 mg芝麻林素分别加入丙酮溶解并定容至 50 mL,配成芝麻酚质量浓度为 50μg/mL、芝麻素酚质量浓度为 50μg/mL、芝麻素质量浓度为 200μg/mL和芝麻林素质量浓度为 120μg/mL的标准液。

1.4 样品的制备

1.4.1 皂化法

按照文献[7]的方法并加以改进。

取 1 g芝麻油加入 15 mL乙醇溶解于 100 mL烧瓶中,加 1∶1的氢氧化钾溶液 8 mL,将烧瓶放在磁力搅拌器上,80℃水浴下反应 30 min,冷却。

芝麻素与芝麻林素的萃取:将皂化物移入分液漏斗中,加入乙酸乙酯萃取 3次,其中每次 30 mL,合并乙酸乙酯萃取液,水洗至中性,减压蒸干乙酸乙酯,得萃取物样品一备用。

芝麻酚与芝麻素酚的萃取:将收集的水层中加入15%H2SO4溶液调节至 pH 3,用二氯甲烷萃取 3次,每次 30 mL。合并二氯甲烷萃取液并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤至弱碱性,再用蒸馏水洗至中性。无水硫酸钠干燥,减压蒸除溶剂。得萃取物样品二备用。

将萃取物两份样品用丙酮溶解后合并,丙酮定容至 25 mL,作为 HPLC检测样品,进样量 10μL。

1.4.2 氧化铝柱层析法

按照文献[6]的方法,并加以改进。

层析柱的制备:190℃下活化层析用氧化铝,采用湿法装柱 (先向柱中加入一定量的石油醚,再把氧化铝用洗脱液浸泡加入,完成后用洗脱液走两遍平衡柱子)。称取 5 g芝麻油用石油醚溶解后上样。接下来先用 100 mL石油醚洗脱,再用 150 mL乙酸乙酯洗脱,收集乙酸乙酯洗脱组分。

乙酸乙酯洗脱组分减压蒸干溶剂后加人丙酮溶解,定容至 25 mL,作为 HPLC检测样品,进行含量测定,进样量 10μL。

1.4.3 薄层层析法

称取 0.1 g的芝麻油样品用丙酮溶解,上样。然后将层析板放入层析缸中展开,展开剂为石油醚 ∶乙酸乙酯 =20∶1。展开结束后,挥干溶剂,在 254 nm下画出木脂素类条带并刮下,用 30 mL乙酸乙酯浸提,超声辅助,过滤,洗涤。将滤液减压蒸干后加人丙酮溶解,定容至 25 mL,作为 HPLC检测样品,进行含量测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

1.3 中配制的芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚的标准溶液分别进样 5μL,以甲醇 ∶水 =70∶30为流动相,在 230～380 nm内进行光谱扫描,以确定各化合物的最大吸收波长,从而确定合适的检测波长。光谱扫描结果显示芝麻素、芝麻林素、芝麻酚和芝麻素酚在试验条件下的最大波长分别为 286、288、294和 292 nm。综合考虑最终选择了 287 nm作为芝麻素和芝麻林素的检测波长,293 nm作为芝麻酚和芝麻素酚的检测波长。

2.2 色谱条件选择

由于芝麻酚和芝麻素酚含有酚羟基,其极性相对较强,而芝麻素和芝麻林素不含酚羟基,极性相对较弱,用 C18反相色谱柱分离时芝麻酚和芝麻素酚的保留时间较短,芝麻素和芝麻林素的保留时间相对较长,若要使 4种物质能够有效分离且保留时间相对较短,需要采用梯度洗脱的方法。HPLC法分离木脂素类化合物一般用甲醇和水作为洗脱剂,为找出最佳的色谱条件,将水的比例在 60%～20%范围内调整,最终确定了表 1所示的洗脱梯度。结合检测波长,确定了 1.2中的色谱条件。以确定的色谱条件对芝麻素、芝麻林素、芝麻酚及芝麻素酚的标准溶液和小磨香油经 1.4.3方法处理后样品进行 HPLC测定,其色谱图如图 1所示,结果显示该色谱条件对目标化合物的分离效果良好,尤其是芝麻素酚的两种异构体也得到分离。

图 1 标样及典型样品的 HPLC测定色谱图

2.3 精密度测定

取一样品溶液连续进样 5次,每次 10μL,计算各物质峰面积的 RSD,所得 RSD结果为芝麻酚0.49%、芝麻素酚 0.36%、芝麻素 0.11%和芝麻林素0.37%。各成分 RSD均小于 1%,精密度良好。

2.4 样品的稳定性测定

取一个样品溶液每 2 h测定一次,计算各物质峰面积随放置时间延长的变化情况,结果在 10 h内,各物质峰面积的 RSD值分别为:芝麻酚 0.68%、芝麻素酚 0.54%、芝麻素 0.41%、芝麻林素 0.51%,结果表明样品溶液中芝麻酚、芝麻素酚、芝麻素和芝麻林素在 10 h内保持稳定。

2.5 标准曲线的建立

将 1.3中配制的标准品溶液分别以 0.2、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15μL的进样量进样,以 1.2的色谱条件测定,以峰面积 (mAU ×min)为横坐标,含量 (μg)为纵坐标,建立标准曲线,拟合回归方程。各物质的回归方程及检测限见表 2。

表 2 四种物质 HPLC测定的拟合回归方程

2.6 3种预处理方法比较

取已知木脂素含量的芝麻油样品溶液,分 3份,每份分为 3个样,共 9个样,分别向每份样品溶液中加入芝麻酚、芝麻素酚、芝麻素和芝麻林素标准品,分别采用 1.4中所述的 3种方法处理,并用 HPLC测定其含量,按回收率 =(实测值 -样品所含被测组分)/加入的样品量 ×100%计算各物质的加样回收率。加样回收率及 RSD%结果见表 3。

表 3 3种方法处理后 4种物质的加样回收率及 RSD%

从表 3可以看出,对于芝麻素和芝麻林素来说,3种方法回收率都在 (100±5)%的合理范围内,RSD值也符合要求。对于芝麻酚和芝麻素酚来说,皂化法和氧化铝柱层析法的回收率都小于 95%,准确性不符合要求,制备薄层层析法的回收率在 98%以上,具有较高的准确性。综合来说,若只检测芝麻素和芝麻林素,3种前处理方法都有效,若同时检测这 4种化合物,则只有制备薄层层析法能达到理想效果。

皂化法和氧化铝柱层析法对芝麻酚和芝麻素酚的回收率较差,这可能与萃取皂化法操作步骤多,耗时长,特别是对芝麻酚和芝麻素酚的萃取所经步骤更多,这可能导致了芝麻酚和芝麻素酚的回收率较差。采用氧化铝柱层析时芝麻酚和芝麻素酚的回收率较差,可能与氧化铝对具有弱酸性物质的吸附能力强有关。

从处理方法本身来说,皂化法操作繁琐,耗量大,耗时长,效率低。氧化铝柱层析法影响因素较多,柱子的装填水平均一性差,对分离过程会有较大的影响,而且耗费的溶剂量大。相比较而言,薄层层析法操作相对简单,消耗溶剂少,各步骤操作一致性好。

3 结论

通过对分离这 4种化合物的色谱分离条件的研究和前处理方法的筛选,建立了 HPLC同时测定芝麻油中这 4种物质的 HPLC测定方法。即采用制备性薄层层析法作为预处理脱除脂肪类成分的方法,方法本身操作简单,一致性好。采用试验中的仪器色谱条件,能对这 4种物质有效分离,并采用外标法建立了各物质的标准曲线。方法一致性强,稳定性、准确性可靠。

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Deter mination ofLignans in Sesame Oil by HPLC

Huang Jinian Song Guohui Sun Qiang Zhan Chuanbao
(Institute ofAgricultural Products Processing,Henan Academy ofAgriculture Sciences,Zhengzhou 450002)

A HPLC method for simultaneously determining contents of lignans,including sesamin,sesamolin,sesamol and sesaminol,in sesame oil has been developed.Separation and content determination of the four lignans were achieved by usingODS-C18column(250 mm ×4.6 mm,5μm)and by a gradient elution using(A)metha2 nol and(B)water as the mobile phase of 0 min(A,60%)→6 min(A,60%)→9 min(A,75%)→24 min(A,70%)→27 min(A,60%)→32 min(A,60%).The flow rate was 0.8 mL/min and column temperature was 30℃.The wavelength was 287 nm for sesamin and sesamolin,and 293 nm for sesamol and sesaminol.Three pretreat2 mentmethods have been compared for the removal of triglyceride from sesame oil,namely saponification,alumina col2 umn chromatography and thin layer chromatography,and results showed that thin layer chromatographywas the best.

sesamin,sesamolin,sesamol,sesaminol,HPLC

TS207.3

A

1003-0174(2011)01-0120-04

河南省杰出青年科学基金(0612001500)

2010-02-09

黄纪念,1971年出生,男,研究员,博士,农产品精深加工与功能食品开发