米糠肽对D-半乳糖致衰小鼠线粒体损伤的影响

樊金娟 付岩松 宗立立 张心昱 罗 霞

(沈阳农业大学生物科学技术学院1,沈阳 110866)

(吉林农业大学农学院2,长春 130118)

(中国科学院地理科学与资源研究所3,北京 100101)

米糠肽对D-半乳糖致衰小鼠线粒体损伤的影响

樊金娟1付岩松1宗立立2张心昱3罗 霞1

(沈阳农业大学生物科学技术学院1,沈阳 110866)

(吉林农业大学农学院2,长春 130118)

(中国科学院地理科学与资源研究所3,北京 100101)

利用 D-半乳糖 (D-gal)致衰小鼠模型,探讨了米糠肽对小鼠心、脑线粒体锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性、丙二醛 (MDA)含量以及总抗氧化能力 (T-AOC)和 Ca2+泵、Na+泵活性的影响,并以透射电镜观察了该肽对小鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响。结果显示,与衰老组相比,高剂量米糠肽 (500 mg/kg)可明显降低小鼠心、脑线粒体MDA含量 (P<0.01),显著提高 T-AOC(P<0.01)、Mn-SOD活性 (P<0.01)以及 Ca2+泵、Na+泵活性,优于中、低剂量 (200、100 mg/kg);透射电镜下可见衰老组肝线粒体肿胀明显,膜模糊不清,有空泡形成,而米糠肽各组线粒体损伤程度有所减轻。说明米糠肽对 D-gal致衰小鼠线粒体损伤起到良好的保护作用,可能具有延缓衰老的效果。

米糠肽 衰老模型 线粒体 超微结构

生物活性肽是具有抗氧化、抗疲劳、调节免疫等多种生理活性的多肽,具有氨基酸不可比拟的功能[1-3]。近年来,活性肽的研究开发受到国内外的广泛关注。目前对于植物源活性肽的研究主要集中于大豆肽和玉米肽,对米糠肽的研究还不多见。米糠是糙米碾臼过程中被碾下的皮层和少量米胚及碎米的混合物,其蛋白质含量高,氨基酸组成符合WHO/FAO推荐的理想模式[4]。利用 AS1.398中性蛋白酶酶解获得的米糠肽对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子 (O2-·)具有较好的清除作用[5],同时该肽能提高小鼠血清超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活性,能够降低脑、肝组织中单胺氧化酶 (MAO-B)活性[6],可能存在抗衰老的功效。

线粒体是维持细胞以至整个机体生理功能的能源中心,被视为细胞衰老的基础。利用 D-gal致衰小鼠模型,观察了米糠肽对心、脑线粒体Mn-SOD、T-AOC、Ca2+泵、Na+泵活性及 MDA含量的影响,旨在为开发安全有效的天然抗衰老食品、保健品提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

米糠,由沈阳千重浪稻业提供。

昆明种小鼠 60只,体重 18～22 g,雌雄各半,由长春医学实验动物研究中心提供,许可证号:SCXK(吉)2008-0001,于本单位标准化动物实验中心饲养。

总蛋白定量测试盒,T-AOC、SOD、Ca2+泵、Na+泵活性测试盒、MDA含量测试盒:购于南京建成生物工程研究所;D-gal、戊二醛等为分析纯。

1.2 仪器与设备

JEM-1200EX透射电子显微镜:日本 JEOL公司;U-3010紫外 -可见分光光度计:日本 H ITA2 CH I;JY92-2D超声波细胞粉碎仪:宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-6数显恒温水浴锅:国华电器有限公司;D-37520 Osterode台式高速冷冻离心机:Thermo公司;T-25 basic ULTRA-TURRAX匀浆机:德国 IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠肽的制备

按本实验室方法进行[5]:利用 AS1.398中性蛋白酶,在 pH 7.0,温度 55℃,[E]/[S]=12%条件下,酶解米糠蛋白 6 h,4 000 r/min离心 10 min得到米糠粗肽,含量约为 105 mg/mL。

1.3.2 试验动物分组及处理

标准饲料饲养小鼠一周后开始正式实验。将 60只小鼠随机分为 5组,每组 12只,雌雄各半,分别为对照组,衰老组,米糠肽低、中、高剂量治疗组。衰老组和米糠肽各组每日按 100 mg/kg颈背部皮下注射D-gal,对照组注射等量生理盐水;米糠肽低、中、高剂量组每日分别灌胃米糠抗氧化肽 100、200、500 mg/kg,对照组、衰老组灌胃等量蒸馏水。每日灌胃、注射一次,连续 6周,期间按性别一组两笼,自由饮食饮水。

末次给药次日,随机抽取各组小鼠两只,脱颈椎处死,迅速取肝脏,切取相同部位 1 mm3组织块,经2.5%戊二醛、锇酸双重固定,丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,切片,用于电镜观察;所有小鼠脱颈椎处死,迅速取脑、心脏,冷生理盐水冲洗、滤纸吸干,于液氮速冻,-70℃保存,用于线粒体生化指标的测定。

1.3.3 线粒体的制备

冰浴中制备 10%的组织匀浆,4℃2 000 r/min离心 10 min,取上清 10 000 r/min离心 15 min,沉淀物即为线粒体。将分离的线粒体用冰冷的匀浆介质制成混悬液,超声波破碎线粒体膜。

1.3.4 指标测定

组织蛋白含量、SOD、T-AOC、Ca2+泵、Na+泵活力、MDA含量按试剂盒说明书方法测定。

1.3.5 统计学分析

数据以平均值 ±标准差 (x-±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,用最小显著差法 (LSD)进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 米糠肽对 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体 Mn-SOD活性、MDA含量及 T-AOC活力的影响

衰老时,小鼠抗氧化能力明显下降,而 MDA水平显著升高[7-8]。由表 1至表 3可知,与对照组相比,衰老组心、脑线粒体中 Mn-SOD、TAOC活力的降低和MDA含量的升高均呈极显著(P<0.01)。而米糠肽各组Mn-SOD及 T-AOC活力均有不同程度地提高,与衰老组相比,中、高剂量组提高显著 (P<0.05或 P<0.01);同时心、脑线粒体MDA含量有不同程度降低,其中高剂量组呈极显著 (P<0.01),接近对照组。说明米糠肽能够增强致衰小鼠的抗氧化能力,并呈一定的剂量相关性。

表 1 米糠肽对 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体Mn-SOD活性的影响

表 2 米糠肽对 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体MDA含量的影响

表 3 米糠肽对D-gal致衰小鼠心、脑线粒体 T-AOC活力的影响

2.2 米糠肽对 D-gal致衰小鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响

电镜观察可见:对照组小鼠肝细胞 (图 1a)核膜光滑,核内染色质分布均匀,胞质内有较多的粗面内质网、核糖体及糖原颗粒,线粒体丰富,排列整齐,内外膜完整,嵴清晰可见。衰老组小鼠肝细胞 (图 1b)核膜稍有切迹,核内异染色质有凝聚,细胞器数量减少,粗面内质网轻度扩张,线粒体出现明显肿胀,空泡化,内外膜模糊不清,基质密度较低,嵴疏松、断裂、变形甚至消失等改变,胞质内还见有较多的溶酶体,说明本实验利用D-半乳糖造模是成功的。与衰老组相比 ,米糠肽各组 (图 1c、图 1d、图 1e)核膜、核内染色质分布状况有不同程度改善,胞质内有较多线粒体、粗面内质网、核糖体及糖原颗粒,但低剂量组胞质有部分溶解,内可见脂滴。从线粒体看,低剂量组多数嵴减少、外膜局部破损;中剂量组轻度肿胀,基质密度较低,少量外膜局部模糊;高剂量组线粒体丰富,排列整齐,外形基本完整,膜清晰,嵴密集,接近对照组水平。说明米糠肽能够对衰老时细胞的损伤起到保护作用。

图 1 米糠肽对D-gal致衰小鼠肝细胞及线粒体超微结构的影响

2.3 米糠肽对 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体 Ca2+泵、Na+泵活性的影响

由表 4可知,衰老组心、脑线粒体 Ca2+泵和 Na+泵活性均显著低于对照组 (P<0.01),而与衰老组相比,不同剂量米糠肽均可增加 Ca2+泵和 Na+泵活性,中、高剂量组可达显著水平 (P<0.05或 P<0.01)。说明米糠肽对 Ca2+泵、Na+泵活性具有调节能力,并呈一定地剂量相关性。

表 4 米糠肽对 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体Ca2+泵、Na+泵活性的影响

3 讨论与结论

随着年龄的增长,机体内自由基产量增多,细胞、组织和器官在形态和功能上将会出现一系列复杂的退行性变化[9-10]。D-半乳糖诱发动物衰老即与自由基毒性和氧化应激损伤有关,已在大鼠和小鼠上证实该模型表现出部分与自然衰老相似的生化变化[11-12]。

线粒体既是体内活性氧、自由基产生的重要场所,又是内源性自由基攻击的主要对象。过多自由基的产生使线粒体内膜受损,主要表现在:膜脂质过氧化水平升高、膜蛋白变性导致酶活性改变、线粒体数量减少[13];同时膜通透性及离子转运受影响而触发 Ca2+内流[14]等。结果表明,经 D-gal处理后,小鼠抗氧化能力下降,脂质过氧化水平升高,Ca2+泵、Na+泵活性降低,线粒体形态结构受损,说明本实验利用 D-gal建立的衰老模型是成功的。

SOD是生物体内特异清除 O2-·的酶[15],其活性随年龄下降,引起衰老有关的变化。MDA是脂质过氧化的最终产物,能严重破坏膜结构,其含量可反映组织过氧化损伤程度和细胞受损程度[16]。T-AOC的大小代表和反映了机体抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力,是反映机体防御体系抗氧化能力强弱和健康程度的综合性指标。结果表明,米糠肽能有效增强线粒体 T-AOC、Mn-SOD活性,降低MDA产生。说明米糠肽的抗氧化作用是其延缓衰老的重要机制之一。

肝脏是机体物质代谢的关键器官,肝细胞的损伤和凋亡是机体衰老的重要标志。肝细胞的凋亡主要表现在细胞核染色质的凝集、线粒体和粗面内质网数量和形态的改变等。结果显示,在电镜下可见衰老组小鼠细胞内结构损伤较重,而米糠肽各组损伤状况有所减轻。其机制可能是米糠肽通过抗氧化作用降低了自由基损伤程度,从而减轻线粒体、内质网等结构的损伤,保护其形态结构及功能的稳定。

Ca2+泵、Na+泵是线粒体呼吸链复合体Ⅴ的重要酶系,具有维持细胞内钙稳态、调节细胞内外 Na+/K+梯度等功能,其活性大小是各种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标[17]。有研究发现,当衰老或疾病状态时机体 Ca2+泵、Na+泵活性下降[18]。试验结果显示,米糠肽可提高 D-gal致衰小鼠心、脑线粒体 Ca2+泵、Na+泵活性。说明该肽能够调节细胞内 Ca2+,为其在细胞器水平上实现延缓衰老、预防老年性疾病提供了可能。

综上所述,米糠肽能够提高致衰小鼠线粒体 TAOC、Mn-SOD及 Ca2+泵、Na+泵活性 ,降低 MDA含量,保护细胞内部形态结构。说明该肽可增强清除自由基的作用,降低脂质过氧化,减轻衰老所造成的损伤,进而维持细胞在能量代谢上的稳定,在细胞器水平上延缓衰老。同时有资料显示,米蛋白不含任何抗营养因子,具有低过敏性及良好的消化性和营养性,无毒无害,且风味柔和、颜色清爽[19-20],是天然医药保健品的优质原料。因而,将其作为抗衰老食品、营养品开发,前景十分广阔。

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Effect of Rice Bran Peptides onMitochondria Injury in AgingMice Induced byD-Galactose

Fan Jinjuan1Fu Yansong1Zong Lili2Zhang Xinyu3Luo Xia1
(College of biotechnology,Shenyang AgriculturalUniversity1,Shenyang 110866)
(College of agricultural,Jilin AgriculturalUniversity2,Changchun 130118)
(Institute of Geographical Sciences and Natural Resources Research3,CAS,Beijing 100101)

The agingmice models induced byD-galactose(D-gal)were created to reveal the effect of rice bran peptides on the activity ofmanganese-superoxide dimutase(Mn-SOD),content ofmalonadehide(MDA),to2 tal antioxidation capacity(T-AOC),and activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in mice heart and brain mitochondria,aswell as on the ultrastructure of liver cell and mitochondria under transmission electron mi2 croscopy(TEM).Results:Compared with aging group,the rice bran peptidesof 500 mg/kg dose greatly decrease the MDA content(P<0.01),significantly increase the T-AOC activity(P<0.01),and enhance the activitiesofMn-SOD(P<0.01),Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase in mice heart and brain mitochondria,and the effects in 500 mg/kg dose group is stronger than groups of 200 or 100 mg/kg dose.The livermitochondria ultrastruc2 ture shows typical injury signs under TEM for aging group,whereas the mitochondria appearance of rice bran peptide groups showsmuch better.All these i mply obviousprotective and anti-aging effectof rice bran peptideson the aging mice induced byD-gal.

rice bran peptide,agingmodel,mitochondria,ultrastructure

TS2

A

1003-0174(2011)01-0030-05

辽宁省教育厅重点实验室项目(2008S207)

2010-02-22

樊金娟,女,1972年出生,副教授,植物资源开发与利用