不同氮源发酵生产豆豉纤溶酶的紫外吸收光谱研究

齐海萍，胡文忠，姜爱丽，田密霞

（大连民族学院教育部国家民委重点实验室，辽宁大连116600）

不同氮源发酵生产豆豉纤溶酶的紫外吸收光谱研究

齐海萍，胡文忠*，姜爱丽，田密霞

（大连民族学院教育部国家民委重点实验室，辽宁大连116600）

采用紫外在线检测方法，对豆豉纤溶酶产生菌UγD8菌株在不同氮源下连续发酵56h，对其发酵特性进行研究，研究结果表明，以酵母膏为氮源发酵产酶时间44h，吸光度Abs最大，为1.4002；以豆浆为氮源发酵产酶时间为36h，Abs为1.0557；以豆渣为氮源发酵产酶时间为48h，Abs为1.3301。所用枯草杆菌UγD8发酵生产豆豉纤溶酶的最佳氮源为酵母膏，产酶量大，但产酶时间晚。其利用率顺序为酵母膏＞豆渣＞豆浆。选用紫外吸收光谱技术用于检测发酵液中有机氮源消耗以及豆豉纤溶酶的产生等动态变化，得到较为理想的结果，且方便快捷，灵敏度高，可以广泛用于发酵过程的监测。

UγD8菌株，紫外吸收光谱，氮源

豆豉纤溶酶是一种丝氨酸蛋白激酶，是从中国传统发酵食品淡豆豉中提取得到的，豆豉纤溶酶具有与链激酶、尿激酶等溶血栓药物同样的溶解血栓作用，比之现用于临床的溶血栓药物，豆豉纤溶酶具有安全性好，易被人体吸收，作用直接迅速，作用持续时间长，可由微生物发酵生产因而造价低廉等优点，是一种很有潜力的新型溶血栓药物［1-2］。近几年，随着检测仪器的精密化和数据处理技术的迅速发展，发酵过程在线检测的研究逐渐深入，一些新兴的检测技术应运而生，如红外光谱技术［3-6］、荧光分析法、离子敏场效应晶体管技术、核磁共振技术、生物传感器技术、质谱分析技术、色谱分析技术等。本文研究了发酵过程中发酵液紫外吸收光谱的变化，分析比较了发酵液吸收光谱的变化与细菌生长以及发酵产酶过程之间的联系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

血纤维蛋白原 购自Sigma公司；牛凝血酶 购自天津血研所；其它药品 均为国产分析纯；产酶菌UγD8菌株 本实验室筛选获得；种子培养基Ⅰ（g/L）葡萄糖 1.5，豆饼粉 2，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO45H2O 0.05，酵母膏提取物0.15，pH 7，121℃，20min；发酵培养基Ⅱ（g/L） 葡萄糖1.5，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO4·5H2O 0.05，pH 7，121℃，20min；液体培养基Ⅲ 在发酵培养基Ⅱ中添加20g/L的不同氮源，酵母膏，豆渣，豆浆。

电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超净工作台 安泰公司；BR4i型台式高速冷冻离心机 法国Jouan公司；UV-2100型紫外可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司；UV-2550双光束紫外光分光光度计 日本岛津；pHS-3C精密pH计上海三北仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的制备 将斜面菌种接入种子培养基，37℃，250r·min-1培养8h，然后以4%的接种量分别接入不同的液体培养基Ⅲ中，37℃，250r·min-1培养56h，每隔4h取1mL发酵液进行以下研究。

1.2.2 豆豉纤溶酶发酵液紫外吸收光谱的测定 取适量发酵液，4℃，8000r·min-1离心10min，取上清，双蒸水稀释25倍进行紫外光谱扫描，其参比为蒸馏水。分光光度计参数设定：中速扫描，扫描范围220～320nm，采样间隔1nm，光谱带宽0.1nm。

1.2.3 豆豉纤溶酶活性测定方法 采用纤维蛋白平板法进行［7］。

1.2.4 发酵过程中菌体浓度的测定［7］取培养不同时间的发酵液加双蒸水稀释20倍，以同样稀释20倍没有接种的培养基为空白对照，660nm测定OD值，以OD值表示菌体浓度的大小。

2 结果与讨论

2.1 以酵母膏为唯一氮源发酵液的紫外扫描分析

图1为发酵0～56h发酵液的紫外吸收情况。由图1（a）可以看出：发酵前4h，发酵液紫外吸收的λmax在258nm左右没有变化，只是其吸收强度显著下降，Abs由1.2561降为1.0260，说明发酵前4h内发酵液中没有新物质成分的生成，只是原有组分的消耗；图1中（b）为发酵4、8h时发酵液的紫外吸收光谱，λmax由258nm位移至266nm，其吸收峰的位置红移了8nm左右，可以推断在4～8h内发酵液中的氨基酸，特别是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的组成以及含量发生变化，可能有新物质的产生；图1中（c）为发酵12、16、28、32h时发酵液的紫外吸收情况，可以看出在发酵16～32h，发酵液紫外吸收的λmax稳定在265nm左右，其吸收强度在逐渐上升，Abs由1.0839升为1.3828，说明了发酵产生新物质的含量在不断升高；图1中（d）为发酵末期44、48、56h时发酵液的紫外吸收情况，λmax虽然没变，但是其吸收强度却有所下降，可能是新物质的含量降低造成的。

图1 氮源为酵母膏的紫外扫描结果

2.2 以豆渣为唯一氮源发酵液的紫外扫描分析

由图2可以看出，氮源为豆渣时，发酵前8h，发酵液紫外吸收的λmax稳定在257nm，Abs有所下降；至发酵24h，发酵液紫外吸收的λmax移至265nm处；发酵24～40h，λmax没有变化，Abs由0.8028升至1.3135；发酵44h以后，Abs有小幅度下降，说明所产生的新物质已开始减少。

图2 氮源为豆渣的紫外扫描结果

2.3 以豆浆为唯一氮源发酵液的紫外扫描分析

由图3可以看出，氮源为豆浆时，发酵液紫外吸收的吸收强度明显较低，且发酵40h以后，Abs已开始下降，说明所产生的新物质已开始减少。

图3 氮源为豆浆的紫外扫描结果

2.4 豆豉纤溶酶发酵中菌体浓度以及产酶量的变化

豆豉纤溶酶发酵56h内菌体浓度的变化见图4。由图4可以看出，2～12h为细菌生长的指数期。该时期细胞生长速率最大、酶系活跃、代谢旺盛，发酵液中的各营养成分消耗较为显著，发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比都将发生显著改变，其中有机氮源物质的含量以及所占比例的变化将会影响其紫外吸收光谱。豆豉纤溶酶发酵过程中发酵液相对酶活的变化，见图5。

图4 豆豉纤溶酶产生菌UγD8发酵56h内菌体浓度的变化

图5 豆豉纤溶酶发酵过程中酶活力的变化

豆豉纤溶酶发酵过程中酶活力的变化（见图5）。发酵前12h主要为细菌生长阶段，基本不产生豆豉纤溶酶。图5显示，豆豉纤溶酶发酵0～8h发酵液的相对酶活几乎为0；发酵8h时开始检测到发酵液中存在豆豉纤溶酶，但相对酶活较低；在发酵20～44h内，豆豉纤溶酶的酶活迅速增加，说明发酵液中豆豉纤溶酶的浓度迅速上升。发酵的最后阶段44～56h内，所检测到发酵液的相对酶活降低了，可能是由于发酵末期豆豉纤溶酶产量降低以及部分降解所致。

3 结论

实验表明：不同氮源对发酵特性的影响非常明显。

豆豉纤溶酶发酵过程中发酵液紫外吸收光谱呈现以上变化的原因为：发酵前期，发酵液紫外吸收的波峰位置基本没有变化，只是其吸收强度显著下降，是由于细菌生长在该时间段处于指数期，细胞代谢旺盛，大量消耗发酵液中各营养成分，导致氮源物质的含量显著降低，所以发酵液的紫外吸收强度显著下降。发酵前中期（大约8～20h）内发酵液紫外吸收的波峰位置发生了位移，是由于该时间段发酵产生了新物质豆豉纤溶酶，新蛋白的产生使得发酵液中氨基酸的组成和结构发生了改变，特别是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的含量发生变化导致了发酵液紫外吸收光谱发生了改变。发酵中期发酵液紫外吸收强度显著升高，因为该时间段刚好是发酵液酶活迅速增加的时期，发酵液中豆豉纤溶酶含量不断增加导致了紫外吸收强度的逐渐升高。发酵末期，由于部分豆豉纤溶酶的降解致使发酵液紫外吸收强度下降，因此，为了酶的高产高收，发酵时间至末期应即时停止发酵，分离提取产物酶。

同时，我们从实验数据中也可以发现，不同氮源发酵，其开始产生新物质（即豆豉纤溶酶）的时间是不同的，豆浆产酶时间较早。所产酶量也有很大不同（见表1）：酵母膏发酵44h的Abs最大，为1.4002；豆浆，36h，1.0557；豆渣，48h，1.3301。由此，我们可以得到以下结论，所用枯草杆菌UγD8发酵生产豆豉纤溶酶的最佳氮源为酵母膏，产酶量大，但产酶时间晚，其利用率顺序为酵母膏＞豆渣＞豆浆。

表1 不同氮源对酶发酵特性的影响

［1］王金英，刘宇峰.豆豉抗栓作用的研究［J］.生物技术，1997，7（5）：18-20.

［2］张萍萍.纤溶酶产生菌的发酵条件优化及酶学性质初探［D］.河北大学硕士学位论文，2006.

［3］邱江，潘红春，韩崇家，等.红外光谱监测糖化酶发酵过程［J］.光谱学与光谱分析，1999，19（6）：831-833.

［4］葛向红，赵元黎，张凤秋，等.癌细胞对血清光谱的影响［J］.光谱学与光谱分析，2004，24（7）：841-843.

［5］赵元黎，张凤秋，葛向红，等.细胞培养基的吸收光谱研究［J］.光谱学与光谱分析，2004，24（8）：907-909.

［6］薛萍，郑文杰.紫外可见光谱在生物无机化学中的应用［J］.广州化工，2002，30（4）：79-82.

［7］齐海萍.豆豉纤溶酶的制备、酶学特性及功能性质研究［D］.江南大学博士学位论文，2004.

Study on fermentation liquid’s absorption spectra in dochi fibrinolytic enzyme fermentation with various nitrogen sources

QI Hai-ping，HU Wen-zhong*，JIANG Ai-li，TIAN Mi-xia
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Education Department and National Nationality Key Lab，Dalian 116600，China）

UV line detection method was utilized in this experiment，strain UγD8 with high productive fibrinolytic enzyme fermented for 56h under various nitrogen sources，the fermentation liquid was detected by UV every 4h. Conclusions showed as below：when yeast extract as nitrogen source，after fermentation for 8h，the new material began to produce，after fermentation for 44h，maximum absorbance（1.4002）appeared，fermentation end，the absorbance decreased.When soybean milk was the sole nitrogen source，the time of new material started to produce was at 4h fermented，in the 36h，absorbance value achieved maximum（1.0557）.Soybean dreg as nitrogen sources，when fermented for 4h，the broth generated new material，in the 48h，the absorbance value climaxed at 1.3301.

strain UγD8；UV absorption spectrum；nitrogen source

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0175-03

2009-12-17 *通讯联系人

齐海萍（1973-），女，博士，讲师，研究方向：食品生物技术。

辽宁省教育厅基金项目（2008135）。