响应面优化γ-谷氨酰甲胺酶法合成条件的研究

李伟桥，沐万孟，江 波，*，张 涛，缪 铭

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

响应面优化γ-谷氨酰甲胺酶法合成条件的研究

李伟桥1，2，沐万孟1，江 波1，*，张 涛1，缪 铭1

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

γ-谷氨酰甲胺是一种具有降血压功能的特殊氨基酸。利用单因素实验及响应面分析方法对γ-谷氨酰转肽酶合成γ-谷氨酰甲胺的条件进行优化，确定了最优合成条件为：酶活力为0.5U/mL，反应时间为5h，反应温度为37℃，底物L-谷氨酰胺浓度为0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩尔比为5.23，反应pH为10.62。在此条件下，γ-谷氨酰甲胺的最大合成量为23.95g/L。

γ-谷氨酰甲胺，合成，优化，响应面

γ-谷氨酰甲胺（γ-Glutamylmethylamide，N-methyl-L-glutamine，GMA）是一种特殊的氨基酸，存在于多种微生物细胞和植物体中，特别是在绿茶中，是绿茶氨基酸的重要组成部分。在对GMA生理功能的研究中发现，其具有能够显著降低血压的功能［1］。高血压病作为现代社会的常见病之一，已经严重威胁到人民的身体健康，GMA降血压的特性使其在治疗高血压方面具有广阔的应用前景。GMA的合成包括化学法［2］和酶法。酶法合成具有选择性高、副产物少和反应条件温和等优点，是理想的途径。目前酶法合成 GMA的途径主要是谷氨酰胺酶（glutaminase，EC 3.5.1.2）和 γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-Glutamylmethylamide synthetase，EC.6.4.3.12），以谷氨酸或谷氨酰胺和甲胺为底物，在ATP（Adenosine-triphosphate，三磷酸腺苷）和金属离子的存在下，合成 GMA［3-6］。而微生物的 γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，2.3.2.4）具有相同的特性，并且用γ-谷氨酰转肽酶能够合成许多γ-谷氨酰类物质［7］。在本实验室前期的研究中，已经利用来自枯草芽孢杆菌的γ-谷氨酰转肽酶，以谷氨酰胺和甲胺为底物成功合成出GMA（论文发表中）。对GMA的合成条件优化，在提高GMA合成效率，扩大GMA的应用范围方面具有重要意义。本研究以酶反应条件影响因素为对象，利用单因素实验法及响应面分析方法，探索GMA合成的最佳条件，对γ-谷氨酰转肽酶合成GMA的条件进行优化，为提高合成GMA的产量和效率提供理论基础和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

γ-谷氨酰转肽酶 来源于实验室保藏菌种Bacillus subtilis SK 11.004［8］，酶活力为250U/g；GMA标样 张家港阿拉宁生化有限公司合成；甲醇、乙腈美国TEDIA公司，色谱纯；其他试剂 均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

恒温振荡水浴锅 江苏金坛亿通电子有限公司；Eppendorf 5804R离心机 德国艾本德股份公司；Agilent 1200液相色谱仪 配有二极管阵列检测器和Rev.B.03.02色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶反应条件 在硼砂/氢氧化钠的缓冲液中，依次加入L-谷氨酰胺、甲胺的水溶液和γ-谷氨酰转肽酶，反应体系中γ-谷氨酰转肽酶为0.5U/mL，总体积为20mL，置于50mL的具塞三角瓶中，150r/min下恒温水浴振荡反应。

1.2.2 GMA的测定 取1mL反应液，将样品煮沸10min灭酶，10000r/min离心10min，吸取上清液，适当稀释后，参照文献方法［9］测定。

2 结果与分析

2.1 GMA合成的单因素实验分析

2.1.1 反应时间对GMA合成的影响 在20mL的反应体系中，酶反应的底物浓度分别为L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，反应温度为 37℃，pH为10.0，取反应时间为0.5、1.5、3、4、5、6h的样品，测定GMA的合成量，结果如图1。

图1 反应时间对GMA合成的影响

由图1可以看出，GMA的合成量随时间的推移不断增大，在反应时间为5h时达到最大值，5h后略有下降。在开始阶段，GMA的合成速率较大，其后逐渐变缓，趋于稳定值。5h之后GMA的含量有所减少，这可能是因为γ-谷氨酰转肽酶除了催化转肽反应，还同时催化γ-谷氨酰类物质的水解反应［10］。

2.1.2 反应温度对GMA合成的影响 在20mL的反应体系中，酶反应底物浓度分别为 L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，取反应时间为5h，pH为10.0，测定反应温度分别为27、32、37、42、47℃时GMA的合成量，结果如图2。

图2 反应温度对GMA合成的影响

由图2可以看出，γ-谷氨酰转肽酶催化合成GMA的反应过程中，温度对反应的影响不大，最适温度为37℃。在较低或较高的温度下，GMA的合成量都略有减少，可能是由于低温下，酶活力较最适宜温度小，GMA的合成量较小；而温度稍高情况下，同时加快了γ-谷氨酰转肽酶的水解反应。

2.1.3 底物摩尔比率（甲胺/谷氨酰胺）对GMA合成的影响 在20mL的反应体系中，L-谷氨酰胺浓度为0.3mol/L，分别添加甲胺浓度至 0.3、0.9、1.5、2.1、2.7mol/L，在反应时间为5h，温度为37℃，pH为10.0的条件下，测定不同底物摩尔比率下GMA的合成量，结果如图3。

图3 底物摩尔比对GMA合成的影响

由图3可以看出，在甲胺/谷氨酰胺的摩尔比值为5时，GMA的合成量达到最大。在γ-谷氨酰转肽酶催化合成GMA的反应过程中，谷氨酰胺为供体，为了最大程度合成GMA，必须使受体的浓度大于供体浓度，但随着受体和供体比率的不断增大，使得供体和受体结合的几率变小［11］，反而降低了GMA的合成量。

2.1.4 底物浓度对GMA合成的影响 在20mL的反应体系中，在反应时间为5h，温度为37℃，pH为10.0的条件下，固定甲胺与L-谷氨酰胺的摩尔比为5∶1不变，调整 L-谷氨酰胺浓度至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，分别测定GMA的合成量，结果如图4。

图4 底物浓度对GMA合成的影响

由图4可以看出，在一定范围内，随着底物浓度的增加，GMA的合成量逐渐增加，在L-谷氨酰胺浓度0.3mol/L、甲胺浓度1.5mol/L时，GMA合成量达到最大。底物浓度继续增大使得GMA的合成量反而变小，这可能是由于γ-谷氨酰转肽酶催化GMA的水解，参与了L-谷氨酰胺的自转肽反应。

2.1.5 反应pH对GMA合成的影响 在20mL的反应体系中，酶反应的底物浓度分别为L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，取反应时间为5h，反应温度为37℃，调整反应pH分别为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，测定不同反应pH下GMA的合成量，结果如图5。

由图5可以看出，在pH11以下，GMA的合成量随pH的升高不断增大，当pH＞11时，GMA的合成量迅速降低。γ-谷氨酰转肽酶催化的转肽反应大多在偏碱性条件下进行［6］，但是在碱性过于强烈的情况下，使得酶活性大大降低，不利于转肽反应的进行。

2.2 响应面优化GMA的合成

由单因素实验可以看出GMA合成过程中，反应时间为5h时GMA的合成量达到最大值，反应温度对GMA的合成影响不大，37℃为反应的最适温度。而底物摩尔比、底物浓度和反应pH对GMA的合成影响很大，因此确定反应时间为5h，反应温度为37℃，在此基础上采用中心组合设计（Central Composite Design），以底物摩尔比（A）、底物浓度（B）和反应pH（C）为自变量，GMA合成量（R1）为响应值设计响应面实验。自变量水平编码见表1，实验设计方案及结果见表2。

图5 反应pH对GMA合成的影响

表1 中心组合实验因素水平编码

表2 GMA合成条件的中心组合实验设计及结果

利用Design expert®7.1软件对实验结果进行方差分析，结果见表3（P值＜0.05为显著项）。

通过对实验数据进行多元回归拟合，得到GMA合成量（R1）对自变量底物摩尔比（A）、底物浓度（B）和反应pH（C）的回归方程为：

方差分析显示该模型显著，相关系数 R2= 95.76%，说明模型能够较好地预测响应值与自变量的关系，校正相关系数=91.95%，说明仅有约4.24%的响应值的总变异不能用该模型表示。由表3可以看出，GMA合成反应中的B、C、A2、B2和C2为显著影响因素，即反应底物浓度、pH、底物摩尔比平方项、底物浓度的平方项和pH的平方项为显著因素。图6～图8分别给出了反应的底物摩尔比与底物浓度、底物摩尔比与pH和底物浓度与pH的交互作用对GMA合成量的响应曲面图。

表3 中心组合实验结果方差分析表

图6 反应pH为11时，底物摩尔比和底物浓度交互作用对GMA合成量的响应曲面图

图7 反应底物浓度为0.3mol/L时，底物摩尔比和pH的交互作用对GMA合成量的响应曲面图

图8 反应为底物摩尔比5时，底物浓度和pH的交互作用对GMA合成量的响应曲面图

对模型方程（1）求导，得出当R1取最大值时，A、B和C的值分别为5.23、0.34和10.62。即模型预测GMA合成最大值时，底物摩尔比为5.23，底物L-谷氨酰胺浓度为0.34mol/L，pH为10.62，此时GMA的合成为24.35g/L。按照模型预测参数，对预测值进行验证，重复三次实验，得到GMA合成浓度的平均值为23.95g/L，和预测值24.35g/L非常接近，说明模型能够很好地解释各参数对GMA合成的变化，即在酶活力为0.5U/mL的情况下，GMA合成的最佳条件为：反应时间为5h，反应温度为37℃，底物L-谷氨酰胺浓度为0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩尔比为5.23，反应pH为10.62。

3 结论

3.1 通过单因素实验确定了γ-谷氨酰转肽酶合成GMA的最佳条件区间，利用中心组合设计响应面实验进一步优化反应条件，确定GMA合成的模型，模型相关系数R2=95.76%，说明模型能够较好地解释GMA合成过程中各因素的影响。

3.2 通过对GMA合成模型的分析，得到GMA合成的最佳条件为：酶活力为0.5U/mL，反应时间为5h，反应温度为37℃，底物L-谷氨酰胺浓度为0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩尔比为5.23，反应pH为10.62。经验证实验得到 GMA合成的平均值为23.95g/L，与预测值相一致。

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Optimization of enzymatic synthesis of γ-Glutamylmethylamide with response surface methodology

LI Wei-qiao1，2，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHANG Tao1，MIAO Ming1
（1.State Key Lab of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

γ-Glutamylmethylamide（GMA）is a unique amino acid which has effective hypotensive action.Using single-factor experiments and response surface methodology，the optimal conditions for GMA synthesis were determined.The optimal conditions were introduced as follows：enzyme activity 0.5U/mL，reaction time was 5h，temperature at 37℃，L-glutamine was 0.34mol/L，molar ratio of methylamine to L-glutamine was 5.23，pH 10.62.Under these conditions，the synthesis of GMA could reach 23.95g/L.

γ-Glutamylmethylamide；synthesis；optimization；response surface methodology

TS201.2

B

1002-0306（2011）01-0215-04

2010-09-21 *通讯联系人

李伟桥（1980-），男，博士研究生，研究方向：食品生物技术。

江南大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向资助项目（SKLF-MB-200804）；江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索资助项目（SKLF-TS-200808）。