细菌型豆豉生理活性物质的研究进展

尹召军 陈卫平 张凤英

(江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045)

细菌型豆豉生理活性物质的研究进展

尹召军 陈卫平 张凤英

(江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045)

豆豉是一种以黑豆、黄豆为主要原料，利用微生物发酵制成的一种传统调味豆制品。根据制曲发酵时参与微生物种类的不同可分为毛霉型、曲霉型、细菌型和脉胞菌型。有关研究表明细菌型豆豉除含有丰富的蛋白质、维生素、氨基酸等营养成分外，还含有蛋白酶、淀粉酶、纤溶酶、活性肽、异黄酮、低聚糖等生理活性成分，具有调理肠胃、预防骨质疏松、防癌、溶栓等保健功效。详述了细菌型豆豉在生产工艺和生理活性物质等方面的研究进展，并对我国细菌型豆豉的研究与开发进行了分析和展望。

细菌型豆豉 生产工艺 生理活性物质

豆豉是以黑豆、黄豆为主要原料，利用微生物发酵制成的一种调味副食品。按制曲微生物不同，可分为米曲霉型 (以北京豆豉、湖南豆豉为代表)，根霉型(以印度尼西亚豆豉为代表)，毛霉型(以四川潼川豆豉为代表)，细菌型 (以山东水豉及日本拉丝豆豉为代表)和脉胞菌型(以印度尼亚昂巧豆为代表)等五大类产品。其中细菌型豆豉大多利用纳豆枯草杆菌(Bacillus Subtilis Natto)在较高温度下繁殖于蒸熟的大豆上，借助其蛋白酶生产出风味独特的食品，日本研究人员用纳豆发酵生产的细菌型豆豉不仅具有丰富的营养成分，而且具有整肠、预防骨质疏松、防癌、溶栓等功效［1］。而我国水豆豉的制作迄今已有2 000多年的历史，其醇厚清香、去腻爽口，含有丰富的蛋白质、维生素、谷氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸等营养成分，具有温中健脾、益气补肾、滋补润燥、舒筋活络等保健功能，已成为享誉中外的名吃之一。主要阐述了细菌性豆豉在生产工艺和生理活性物质等方面的研究进展，以期为我国细菌型豆豉的发展提供参考。

1 生产工艺研究

1．1 纳豆的生产工艺

纳豆(Natto)是日本的传统发酵食品，它是以大豆为原料，经纳豆芽孢杆菌发酵而成的细菌型豆豉，其主要传统制作方法是将精选的黄豆浸泡煮熟，然后用稻草包扎起来，维持一定的温湿度，培养1～2 d［2］。发酵过程中，豆粒会被一种黏稠状的能拉成细长丝的聚合物所覆盖，研究发现其主要成分为果糖和γ－多聚谷氨酸(PGA)，其中PGA是黏性物质的主要成分，它是由谷氨酸构成的单一氨基酸的聚合物，是一种对人体和环境无毒害的生物相溶性新型天然高分子，具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保湿和粘接等功能，有着极大的开发价值［3］。目前美国和日本对其研究比较深入。

现在纳豆已发展成为纯培养接种、以现代工艺为基础的生产方法。其一般工艺流程为:

1．2 水豆豉的生产工艺

水豆豉主要是云、贵、山东一带民间制作的家常豆豉，其微生物主要是枯草杆菌以及少量的微球菌和乳酸菌。民间制作时主要有两种方法，一种是没有经过后发酵的半成品(俗称臭豆豉)，我国山东鲁南一带做法:在太阳能晒到的地上挖一深50～80 cm的土坑，坑底及四周用麦秸垫衬好，将水煮后的大豆捞出，沥去余水，以泥瓦盆盛或麻布袋包裹放入坑内，上面用麦秸盖平，后培土保温培养，防止雨水渗入，3～4 d即可焐好取出，焐好的熟豆呈淡褐色，豆与豆之间有较长黏丝相连，并伴有一股浓郁的豉香味，略带氨臭，食用时放入适量的盐、辣椒和切碎的生姜即可;另一种是经过发酵后熟的成品，其制作方法是:在已发酵好的豆豉半成品中加入食盐、香辛料和白酒等辅料，继续发酵5～7 d。李祥［4］通过研究发现水豆豉的制曲发酵温度，时间和辅料添加量均对产品风味、品质有一定影响，一般宜采用30～32℃，发酵7 d为最佳，辅料添加量以各地口味不同而配方不同，其常规工艺流程为:

1．3 水豆豉生产中存在的问题

豆豉始创于中国，在唐代随我国佛教文化一同东渡日本。目前日本纳豆年产量达20万吨左右，已畅销日本全国且辐射到周边地区，尤其是对其生理功能的进行深入研究后，其发展势头更是令人瞩目。

我国豆豉尽管历史悠久，但目前其生产中仍存在很多问题:一是传统的细菌型豆豉菌种没有明确的分离鉴定，难以实现大规模的生产;二是生产厂家多采用传统的自然发酵工艺，发酵过程中各项条件难以控制，可能会引起食品安全问题;三是豆豉制作中一般添加12% ～18%的食盐用于防腐，高浓度食盐对发酵豆制品的酶具有抑制作用，难以保证其良好的品质;四是传统发酵豆豉多属于调味品，自身营养和活性成分没有得到充分的挖掘，限制了中国豆豉被消费者认同范围的扩大和市场前景的发展［5］。

2 细菌型豆豉中生理活性物质的研究

2．1 溶栓成分

血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康的心血管疾病，根据WHO公布的统计数字，全世界现在患有各种血栓性疾病的患者有1 500万之多，其中每年约有300万患者死亡，同时还发现这种状况向低龄化发展。我国正进入老龄化社会，目前60岁以上的老人己达到1亿以上，占人口比例的8．7%，而血栓性疾病又是中老年人的高发病。血栓病能否得到及时有效的治疗关系到中老年人的生存时间和生活质量［6］。目前，治疗血栓性疾病主要有3种方法，外科手术、服用抗凝剂和溶栓疗法，其中溶栓疗法由于其无创性，简便易行，价格也较外科手术便宜，已成为目前广为流行的方法［7－8］。

1987年日本的须见洋行博士首次从纳豆中提取纯化出一种具有溶解交联纤维蛋白功能的纳豆激酶(nattok－inase，简写NK)，该酶具有显著的体内溶栓作用，且起效快、安全性强［9］。Suzukia 等［10］研究发现，高、中、低剂量的纳豆激酶均能显著地降低血浆优球蛋白的溶解时间，降低血浆纤维蛋白原的含量，显著地增加纤维蛋白裂解产物的含量。这引起了我国学者对豆豉中纤溶成分的广泛关注，董明盛等［11］从豆豉中分离得到产纤溶酶的高活力枯草芽抱杆菌，经确定与纳豆菌同为芽抱杆菌属枯草杆菌群，在营养平板上菌群灰白色，表面粗糙有皱折，边缘不规则，无光泽，不透明，厌氧不生长，为革兰氏阳性菌，在优化条件下，发酵液酶活达683．3 IU/mL。彭勇等［12］以豆豉为材料分离得到高产纤溶酶的菌种DC－2和DC－4，对其进行基因和分子水平的研究，结果表明DC－2菌和纳豆杆菌是同一菌群;然而DC－4菌株的纤溶活性达到520 IU/mL，并且具有良好体外溶栓效果，经鉴定为解淀粉芽抱杆菌，与纳豆激酶不同，但酶的生化性质和生物学功能相似，命名为豆豉纤溶酶，此为国内外首次报道。阎家麒等［13］也从豆豉中分离纯化出一种活性强的纤溶酶，测得相对分子质量为31 000，等电点为8．6±0．2;豆豉纤溶酶的急性毒性试验发现:豆豉纤溶酶各剂量组给小鼠灌胃后，任何剂量水平均无明显毒性表现，直至最大剂量 80 g/kg时仍测不出 LD50，则 MTD＞80g/kg。庞庆芳等［14］研究发现山东临沂的细菌型豆豉也含有溶栓成分，其半成品和成品的溶栓活性分别为84．764 U/mL和78．382 U/mL。豆豉溶栓酶作为新型纤溶酶，无论开发为抗血栓药物或是预防血栓病的保健食品，都具有十分重要的意义。

2．2 大豆异黄酮

大豆异黄酮(Isoflavones of soybean)是目前大豆及其发酵制品中重要的一种功能性成分，属于酚类化合物，对动物和人具有有效的生物效应，如抗癌、抗氧化、改善妇女更年期症状等。大豆中含有的大豆异黄酮迄今为止已知共有12种异构体，分为游离型的苷元(aglycon)和结合型的糖苷(glucosides)两类，苷元包括染料木素(genistein简称Gen)、大豆素(daidzein简称Dai)和黄豆黄素(glycitein简称Gly)3种，占总量的2% ～3%。结合型糖苷由3种苷元衍生而成，主要以染料木苷(genistin)、大豆苷(daidzin)和6”－O－丙二酰基染料木苷(6”－O－maloylgenistin)等9种形式存在，占总量的97% ～98%［15］。H．Wei等［16］指出，大豆异黄酮各组分中能够产生生理活性的是游离苷元，而不是结合糖苷，因此，游离苷元(主要是Gen和Dai)是大豆异黄酮的主要活性组分。

大豆异黄酮在豆豉发酵过程中经微生物作用，会产生一定的变化。葛喜珍等［17］研究发现，淡豆豉可使糖尿病小鼠MDA(丙二醛)、血糖和果糖胺明显降低，SOD(超氧化物歧化酶)明显升高，具有显著的降糖和抗氧化作用。张炳文等［18］通过对豆豉与发酵酸豆乳的研究发现，发酵处理基本上不改变异黄酮的总含量，但是糖苷型大豆异黄酮在β－葡萄糖苷酶的作用下大部分转化为游离型异黄酮，可使游离型大豆异黄酮的质量分数从2．36%提高至96．8%。董青等［19］以豆豉为原料筛选得到一株高产大豆异黄酮β－葡萄糖苷酶的杆菌菌株，并通过单因素和正交试验研究确定了该菌株最佳产酶条件，其绝对酶活可达5．49 μg/mL。所以可以利用一些杆菌产β－葡萄糖苷酶这一特性研发出具有较高保健价值的豆豉产品。

2．3 大豆多肽

大豆多肽，又名大豆肽，是指大豆蛋白经蛋白酶或微生物作用后分解得到的低聚肽混合物，其氨基酸组成与大豆蛋白质完全一样，但大豆多肽具有比大豆蛋白更丰富的功能特性。

其生理功能主要有:降胆固醇、降血压 抗氧化、免疫调节、促进微生物发酵、调节胰岛素、促进脂肪代谢等作用［20］。程丽娟等［21］指出豆豉经微生物作用后水溶性蛋白的含量提高了3～6倍，低分子与中分子肽的含量提高了3～8倍，α－氨基酸态氮的含量提高了100多倍。易维学［22］研究发现大豆多肽可明显抑制ACE(血管紧张素转化酶)的活性，阻碍ACE酶催化水解血管紧张素Ⅰ成为血管紧张素Ⅱ，起到降血压的作用，因此，豆豉可作为保健食品对老年人高血压、高胆固醇、心脑血管疾病起到很好的防治作用。此外，还有研究表明，大豆多肽具有促进细菌、霉菌、放线菌、酵母菌等微生物生长繁殖作用，而氨基酸和大豆蛋白都无此作用。

2．4 大豆低聚糖

大豆低聚糖是大豆或其他豆科作物种子中所含有的可溶性寡糖的总称，主要成分为蔗糖、棉籽糖和水苏糖，它们在成熟大豆中的干基质量分数分别为5%、1．7%和3．7%。其主要生理功在于棉子糖和水苏糖对双歧杆菌有明显增殖特性，双歧杆菌能选择性地将大豆低聚糖水解成醋酸和乳酸，使肠内的pH下降，从而抑制肠道内有害菌的生长起到整肠作用［23］。但是棉籽糖和水苏糖也是引起胃气胀的主要原因，因为在单胃动物和人的消化道里没有水解α－1，6半乳糖基链的α－半乳糖苷酶，所以完整的低聚糖不能被吸收。而在豆豉在发酵过程中，由于微生物的合成及酶解作用，低聚糖发生了很大的变化，从而很大程度改善了低聚糖的生理功能。现已发现豆豉中低聚糖的种类主要有低聚果糖、蔗果三糖(包括其三种异构体)低聚半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等。其中，低聚果糖主要是由蔗果三糖的3种异构体在果糖基转移酶的作用下形成的;而低聚半乳糖是由β－半乳糖苷酶转糖基作用形成的，豆豉中许多微生物如枯草杆菌、根霉和毛霉等都会产生半乳聚糖酶，可水解半乳聚糖产生低聚半乳糖;低聚异麦糖是支链淀粉的酶解产物;而低聚木聚糖酶是木聚糖受木聚糖酶降解所得的产物［24］。

2．5 蛋白黑素和大豆皂苷

蛋白黑素是大豆蛋白质以及它的分解产物多肽类与还原糖之间作用发生美拉德(Mailand)反应生成的一种褐色水溶性的大分子物质。它是一类弱酸性高分子，呈水溶性，等电点为pH 2～3，具有一种特有的强蓝色萤光。另外，它还具有很强的抗氧化作用，在酸或碱条件下很容易被水解，然而不受消化酶降解。其表现出的强抗氧化括性，主要是由于其分子内保持有稳定的自由基结构，此结构能捕集溶液中的自由基。会与铁、铜等金属离子相结合，形成不溶的化合物析出。研究表明，蛋白黑素主要有以下几点生理功能:(1)类似食物纤维的功能;(2)改善耐糖效果(抑制了α－淀粉酶或α－葡萄苷酶的活性);(3)胰蛋白酶抑制剂活性;(4)抑制生成亚硝胺作用;(5)抑制ACE活性作用;(6)与矿物质的结合性等［25］。

大豆皂苷是由三萜类同系物(皂苷元)与糖(或糖酸)缩合形成的一类化合物。近年来研究表明大豆皂苷具有许多生理功能，包括通过结合胆汁酸起到降低胆固醇的作用;抑制肝脏功能障碍作用;抑制过氧化脂质生成以及分解的作用;抑制或延缓肿瘤的作用;溶血作用;抗HIV(人类免疫缺陷病毒)作用;活性氧消去作用等［26］。孙学斌［27］从对 C57 和SWISS 2种荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫器官研究人手，对大豆皂苷的免疫效应进行了探讨，结果发现经大豆皂苷喂饲的荷瘤小鼠脾脏，胸腺明显增生，证明了大豆皂苷对小鼠的免疫功能有广泛的调节作用;Nakashima等［28］进行了大豆皂苷对HIV抑制作用的研究，认为其中大豆皂苷B1在大于0．5 g/L时感染6 d后能完全抑制HIV诱导的细胞病变及病毒特异的抗原表达，它是通过阻止了HIV同T4细胞的接触而起作用的。

2．6 复合消化酶

复合消化酶(复合酵素)是由多种消化酶在一定条件下复配产生的酶制剂。具有促进碳水化合物、脂肪、蛋白质、纤维消化和减少肠内气体的作用，是一种新型、高效、无毒副作用的绿色添加剂。复合酶制剂作为禽畜饲料添加剂已广泛应用于养殖业，它能有效提高饲料利用率，降低畜禽排泄物中养分的含量，减少环境污染，消除饲料中的抗营养因子，扩大非常规性饲料原料的应用等［29］。而复合消化酶作为食品添加剂则刚刚起步，国内研究罕见报道。它可专用于胃肠功能欠佳、肝功能不良、易疲劳等人群，陈娴［30］通过对消化不良症状患者的临床研究发现，韩国吉达复合消化酶胶囊可以有效促进患者对各种植物纤维、蛋白质和脂肪的分解、消化、吸收，增加肠内气体排除，消除腹部胀满等，并且还具有一定的利胆和护肝作用。

但是单一酶制剂的复配大多只指出了粗酶制剂整体最佳用量，并且没有考虑到单酶之间的互作效应，很难发挥余酶以外的一些生理功能。而细菌型豆豉不仅具有很高的营养价值，其可溶性氮、糖、类黄酮、维生素B1、维生素B2以及维生素E的含量均高于原料大豆，更为重要的是它还含有其他食品所不含有的天然生物复合酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶和脲酶等，另外还含有一些未知的生长因子，使其功能性相对单一消化酶的复配大大提高，具有提高免疫力，调理胃肠，改善消化吸收，增强体质等功效［5］。通过对临沂特产臭豆豉的研究发现，其浸提液含有大量蛋白酶(图1)、淀粉酶(图2)和果胶酶等，具有较好的生物效应，并从中分离筛选得到两株高产复合酶的菌株Y－2、Z－3(初步鉴定为枯草杆菌和微球菌)，对其发酵产酶条件进行了优化，可针对性的用于食用复合消化酶的研究开发，为我国传统发酵食品的研究利用提供了一定的参考［31－33］。

图1 臭豆豉浸提液蛋白酶活力

图2 臭豆豉浸提液淀粉酶活力

3 展望

细菌型豆豉具有良好的营养价值和极佳的生理功能，所以对其各种功能性成分的研究显得尤为重要。国外研究以日本Natto、印尼Tempe研究较为深入，他们除了改进豆豉的生产工艺外，近十几年更是主要研究这类发酵食品的保健功能，如日本现已将纳豆深加工为胶囊、口服液等，开发出多种纳豆保健品。相比之下，中国细菌型豆豉从生产原料、生产菌株到生产工艺都与日本纳豆极其相似，但是当前对其功能成分的研究还不够深入。其研究主要集中在优良菌种选育和传统工艺改造上，应进一步研究各种功能性成分在发酵过程中变化;运用保健食品研究新技术、新方法，对豆豉特殊功能成分进行分离、提取及保健功能研究，揭示药食兼用的豆豉生理活性物质，明确其保健功能成分;深入研究豆豉活性成分结构、作用机理及其加工稳定性等，从而进一步挖掘我国丰富的食疗宝库，提高我国传统发酵大豆食品的质量、档次与市场竞争力。

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Advance of Research on Functional Components of Bacteria－Fermented Douchi

Yin Zhaojun Chen Weiping Zhang Fengying

(Institute of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045)

Douchi is a traditional soy condiment fermented by microorganism with black beans and soybeans as material，which can be classified as mucor － fermented douchi，aspergillus － fermented douchi，bacteria － fermented douchi and Neurospora－fermented douchi based on the microorganisms involved．Related studies reveal that bacterial douchi is not only rich in nutritional ingredients like protein，vitamins，amino acids，but also rich in protease，amylase，fibrinolysin，bioactive peptides，isoflavone，oligosaccharide and other active components，being able to coordinate intestines and stomach，prevent osteoporosis，cancer，and thrombolysis，and play other role of health protection．In this paper，recent advance in the production processing technology and research on functional components of bacteria － fermented douchi are summarized and the prospect is discussed．

bacteria － fermented douchi，production processing technology，functional component

TS26

A

1003－0174(2011)03－0119－06

江西省科技厅项目(2009BNA07000)

2010－04－07

尹召军，男，1984年出生，硕士，食品微生物

陈卫平，男，1958年出生，教授，硕士生导师，食品微生物